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考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白濃度的實(shí)驗(yàn)方法
閱讀：2241 發(fā)布時(shí)間：2012-10-26（一）考馬斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)原理
雙縮脲法（Biuret法）和Folin―酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制,，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫?a >蛋白質(zhì)溶液測(cè)定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn),，因而正在得到廣泛的應(yīng)用,。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質(zhì)測(cè)定法,。
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的zui大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm,，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為,，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合,。
在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比,。
Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：
（1）靈敏度高,，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其zui低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg,。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多,。
（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便,，只需加一種試劑,。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右,。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程,，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,，且在5分鐘至20分鐘之間,，顏色的穩(wěn)定性。因而*不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間,。
（3）干擾物質(zhì)少,。如干擾Lowry法的K+、Na+,、Mg2+離子,、Tris緩沖液、糖和蔗糖,、甘油,、巰基乙醇,、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。
此法的缺點(diǎn)是：
（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差,，在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g―球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差,。
（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定,，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100,、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH,。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。
（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性,，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算,，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。
（二）考馬斯亮蘭法試劑與器材
1. 試劑：
（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,，用 g―球蛋白或牛血清清蛋白（BSA）,，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。
（2）考馬斯亮蘭G―250染料試劑：稱(chēng)100mg考馬斯亮蘭G―250,，溶于50ml 95%的乙醇后,，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升,。
2. 器材：
（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì) （2）旋渦混合器 （3）試管16支
（三）考馬斯亮蘭法操作方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)方法
（1）取16支試管,，1支作空白，3支留作未知樣品,，其余試管分為兩組按表中順序,，分別加入樣品、水和試劑,，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0,、0.01、0.02,、0.04,、0.06、0.08,、0.1ml,，然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1ml。zui后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G―250試劑,，每加完一管,，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）,。未知樣品的加樣量見(jiàn)下表中的第8,、9,、10管。
（2）加完試劑2~5分鐘后,，即可開(kāi)始用比色皿,，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管,，即0.1mlH2O加5.0mlG―250試劑,。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿,，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗,，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡,。
（3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo),，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖,，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A595值,，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量,。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。
2. 微量法
當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（10－100mg/ml）,可將取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對(duì)照則分別為0.5ml或1.0ml H2O, 考馬斯亮藍(lán)G－250試劑仍加5.0ml, 同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,，測(cè)定595nm的光吸收值,。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。