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技術(shù)專欄:關(guān)于流式細胞術(shù)（FCM）
閱讀：843 發(fā)布時間：2024-7-15FCM是利用流式細胞儀對處在快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個,、多參數(shù),、快速的定性,、定量分析或分析技術(shù),。然而,，在FCM的實際應(yīng)用過程中,，要想得到高質(zhì)量的流式數(shù)據(jù)卻并非易事。現(xiàn)就FCM實驗中的常見問題進行分析,，希望能幫助相關(guān)實驗人員提高實驗成功率,。
一、怎么選擇合適的對照,？
1）同型對照：使用同型抗體做平行實驗,，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結(jié)合。
2）陰性細胞對照：使用已知的不表達目標抗原的細胞做平行實驗,，主要目的是消除抗體的非特異性結(jié)合,。
3）二抗對照：第二抗體多為熒光標記的多抗，非特異性結(jié)合一般較高,，可能造成基礎(chǔ)熒光值偏高,，設(shè)立二抗對照平行實驗的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。
4）陽性對照：一般會使用已知的高表達目標抗原的細胞做平行實驗,，主要目的是排除實驗中實驗方法,、試劑、操作等實驗的影響因素,。
5）空白對照：不進行任何標記的細胞,，主要目的是用于測定基礎(chǔ)熒光信號表達值。
二,、收集的細胞通過流式儀檢測時,，一般多少的細胞量合適？
進行流式檢測時,，至少需要記錄5000個活細胞,，一般調(diào)整細胞密度至1*106/100ul進行流式檢測,。
三、FCM檢測過程中如何設(shè)門（gating）,？
一般根據(jù)散射光進行設(shè)門,，即我們通常所說的前散（forward scatter, FSC）和側(cè)散（side scatter, SSC）來設(shè)門。FSC的大小與細胞的直徑成正相關(guān),，不同的細胞,，細胞越大，其FSC越大,；反之越小,。SSC的大小與細胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成正相關(guān)，不同的細胞,，細胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,，質(zhì)量越大，其SSC越大,；反之越小,。
四、FCM檢測過程中如何調(diào)節(jié)補償,？
在FCM檢測過程中,，如果存在多色，則必須進行熒光補償調(diào)節(jié),。調(diào)節(jié)補償首先要知道雙陰性細胞的情況,，其次，必須要用單陽和雙陰性細胞,。只有在有陰性細胞作為參照的情況下,，才能既不會過多又不會過少地調(diào)節(jié)補償。
五,、FCM檢測時,，每次實驗的細胞數(shù)一定要相同嗎？
FCM檢測時,，若不進行細胞計數(shù)而憑感覺隨意進行實驗會直接影響實驗結(jié)果,。當細胞量多而抗體量不變或細胞量不變而抗體量減少，那么熒光抗體平均分布到每個陽性細胞上的量就會相對減少,。由此可見，不同的細胞量會影響最終的實驗結(jié)果,。因此,，在準備樣本時，必須進行細胞計數(shù),，使每個分組及每次實驗的細胞數(shù)保持一致,。