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技術(shù)專欄:關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)(FCM)
閱讀:884 發(fā)布時(shí)間:2024-7-15FCM是利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù),、快速的定性、定量分析或分析技術(shù)。然而,,在FCM的實(shí)際應(yīng)用過程中,要想得到高質(zhì)量的流式數(shù)據(jù)卻并非易事?,F(xiàn)就FCM實(shí)驗(yàn)中的常見問題進(jìn)行分析,,希望能幫助相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提高實(shí)驗(yàn)成功率。
一,、怎么選擇合適的對(duì)照,?
1)同型對(duì)照:使用同型抗體做平行實(shí)驗(yàn),主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結(jié)合,。
2)陰性細(xì)胞對(duì)照:使用已知的不表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn),,主要目的是消除抗體的非特異性結(jié)合。
3)二抗對(duì)照:第二抗體多為熒光標(biāo)記的多抗,,非特異性結(jié)合一般較高,,可能造成基礎(chǔ)熒光值偏高,設(shè)立二抗對(duì)照平行實(shí)驗(yàn)的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色,。
4)陽性對(duì)照:一般會(huì)使用已知的高表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn),,主要目的是排除實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法、試劑,、操作等實(shí)驗(yàn)的影響因素,。
5)空白對(duì)照:不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞,主要目的是用于測(cè)定基礎(chǔ)熒光信號(hào)表達(dá)值,。
二,、收集的細(xì)胞通過流式儀檢測(cè)時(shí),一般多少的細(xì)胞量合適,?
進(jìn)行流式檢測(cè)時(shí),,至少需要記錄5000個(gè)活細(xì)胞,,一般調(diào)整細(xì)胞密度至1*106/100ul進(jìn)行流式檢測(cè)。
三,、FCM檢測(cè)過程中如何設(shè)門(gating),?
一般根據(jù)散射光進(jìn)行設(shè)門,即我們通常所說的前散(forward scatter, FSC)和側(cè)散(side scatter, SSC)來設(shè)門,。FSC的大小與細(xì)胞的直徑成正相關(guān),,不同的細(xì)胞,細(xì)胞越大,,其FSC越大,;反之越小。SSC的大小與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成正相關(guān),,不同的細(xì)胞,,細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,質(zhì)量越大,,其SSC越大,;反之越小。
四,、FCM檢測(cè)過程中如何調(diào)節(jié)補(bǔ)償,?
在FCM檢測(cè)過程中,如果存在多色,,則必須進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié),。調(diào)節(jié)補(bǔ)償首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況,其次,,必須要用單陽和雙陰性細(xì)胞,。只有在有陰性細(xì)胞作為參照的情況下,才能既不會(huì)過多又不會(huì)過少地調(diào)節(jié)補(bǔ)償,。
五,、FCM檢測(cè)時(shí),每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)一定要相同嗎,?
FCM檢測(cè)時(shí),,若不進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)而憑感覺隨意進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞量多而抗體量不變或細(xì)胞量不變而抗體量減少,,那么熒光抗體平均分布到每個(gè)陽性細(xì)胞上的量就會(huì)相對(duì)減少,。由此可見,不同的細(xì)胞量會(huì)影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。因此,,在準(zhǔn)備樣本時(shí),必須進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),使每個(gè)分組及每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)保持一致,。