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技術(shù)專欄:關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)（FCM）
閱讀：885 發(fā)布時(shí)間：2024-7-15FCM是利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè),、多參數(shù),、快速的定性,、定量分析或分析技術(shù),。然而,，在FCM的實(shí)際應(yīng)用過程中,，要想得到高質(zhì)量的流式數(shù)據(jù)卻并非易事。現(xiàn)就FCM實(shí)驗(yàn)中的常見問題進(jìn)行分析,，希望能幫助相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提高實(shí)驗(yàn)成功率,。
一、怎么選擇合適的對(duì)照,？
1）同型對(duì)照：使用同型抗體做平行實(shí)驗(yàn),，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結(jié)合。
2）陰性細(xì)胞對(duì)照：使用已知的不表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn),，主要目的是消除抗體的非特異性結(jié)合,。
3）二抗對(duì)照：第二抗體多為熒光標(biāo)記的多抗，非特異性結(jié)合一般較高,，可能造成基礎(chǔ)熒光值偏高,，設(shè)立二抗對(duì)照平行實(shí)驗(yàn)的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。
4）陽性對(duì)照：一般會(huì)使用已知的高表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn),，主要目的是排除實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法,、試劑、操作等實(shí)驗(yàn)的影響因素,。
5）空白對(duì)照：不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞,，主要目的是用于測(cè)定基礎(chǔ)熒光信號(hào)表達(dá)值。
二,、收集的細(xì)胞通過流式儀檢測(cè)時(shí),，一般多少的細(xì)胞量合適？
進(jìn)行流式檢測(cè)時(shí),，至少需要記錄5000個(gè)活細(xì)胞,，一般調(diào)整細(xì)胞密度至1*106/100ul進(jìn)行流式檢測(cè)。
三,、FCM檢測(cè)過程中如何設(shè)門（gating）,？
一般根據(jù)散射光進(jìn)行設(shè)門，即我們通常所說的前散（forward scatter, FSC）和側(cè)散（side scatter, SSC）來設(shè)門,。FSC的大小與細(xì)胞的直徑成正相關(guān),，不同的細(xì)胞，細(xì)胞越大,，其FSC越大,；反之越小,。SSC的大小與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成正相關(guān)，不同的細(xì)胞,，細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,，質(zhì)量越大，其SSC越大,；反之越小,。
四、FCM檢測(cè)過程中如何調(diào)節(jié)補(bǔ)償,？
在FCM檢測(cè)過程中,，如果存在多色，則必須進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié),。調(diào)節(jié)補(bǔ)償首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況,，其次，必須要用單陽和雙陰性細(xì)胞,。只有在有陰性細(xì)胞作為參照的情況下,，才能既不會(huì)過多又不會(huì)過少地調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
五,、FCM檢測(cè)時(shí),，每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)一定要相同嗎？
FCM檢測(cè)時(shí),，若不進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)而憑感覺隨意進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。當(dāng)細(xì)胞量多而抗體量不變或細(xì)胞量不變而抗體量減少，那么熒光抗體平均分布到每個(gè)陽性細(xì)胞上的量就會(huì)相對(duì)減少,。由此可見,，不同的細(xì)胞量會(huì)影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,，在準(zhǔn)備樣本時(shí),，必須進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使每個(gè)分組及每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)保持一致,。