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ELISA實驗稀釋血清具體步驟
閱讀：489 發(fā)布時間：2024-7-3先把蛋白稀釋一定的倍數(shù)，比如說10倍,、20倍稀釋（這樣可以大體確定一個參數(shù)）,，將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌,，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng),，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色,，終止反應(yīng)后分別測定o.d值,，選擇o.d值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個o.d值稍大于1.0,，而不選擇小于1.0的抗原濃度,。陰性參考血清o.d值要求<0.1-0.2,。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的o.d值有明顯差別。
在ELISA試劑盒實驗血清為什么要稀釋,？有兩個原因：
1.競爭抑制比較明顯,，應(yīng)稀釋競爭物；
2.血清中含有的性腺激素比較低,，應(yīng)該濃縮才對,。
ELISA試劑盒血清標(biāo)本的保存建議有以下幾點：
1.樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的生長,，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用,；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
2.血清標(biāo)本如是以無菌操作分離,，則可以在2～8℃下保存一周,，ELISA如為有菌操作，則建議冰凍保存,。樣本的長時間保存,，應(yīng)在-70℃以下。
3.冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融,。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,，從而引起假陰性結(jié)果。此外,，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意,，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可,。
4.要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血,。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類似過氧化物的活性,，因此,，在以HRP為標(biāo)記酶的測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高,，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相,，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。
5.標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時,，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測,。
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