化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
技術(shù)專欄:磷酸化蛋白WB實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
閱讀：1387 發(fā)布時(shí)間：2024-4-28蛋白磷酸化是一種非常重要的翻譯后加工,，做信號(hào)通路必然是要檢測(cè)蛋白磷酸化的,，Western blot是評(píng)估蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法,，其實(shí)和跑正常蛋白沒(méi)什么出入,，只不過(guò)孵育的是識(shí)別磷酸化的抗體,。下面恒遠(yuǎn)生物帶大家總結(jié)一下實(shí)驗(yàn)中的注意要點(diǎn)。
一,、關(guān)于磷酸化蛋白樣品
裂解液?jiǎn)栴}蛋白的磷酸化是一個(gè)非常迅速的反應(yīng),，取樣品的過(guò)程要迅速，樣品要新鮮,，樣品處理最好在冰上操作,，操作時(shí)間盡量短。用PBS洗滌細(xì)胞時(shí),，PBS一定要4℃預(yù)冷,。如果是組織的話，提取蛋白時(shí)采用液氮研磨的方法,，研磨器具最好提前預(yù)冷,，保持低溫的狀態(tài)。
提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鮮配制,，裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,，否則即使條帶壓出來(lái)也會(huì)很淺，結(jié)果也不可信,。okadaic acid,，NaF是磷酸酶抑制劑。再者,，還要看你檢測(cè)的蛋白磷酸化位點(diǎn)是什么氨基酸,。
二,、關(guān)于WB時(shí)背景和條帶的問(wèn)題
磷酸化蛋白WB時(shí)背景也往往較深，所以壓片時(shí)間要適當(dāng),，不能太長(zhǎng)或過(guò)短,，太長(zhǎng)則背景太深蓋住想要的那條帶，時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有條帶或者條帶太淺,。做磷酸化蛋白WB時(shí),，除了目標(biāo)蛋白的條帶以外，往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的條帶,。磷酸化抗體不好的話,，甚至?xí)撼龇翘禺愋缘臈l帶，反而沒(méi)有你想要的條帶,，所以壓片后,，一定要根據(jù)Markers比對(duì)一下你壓出的條帶分子量是否正確,。
三,、關(guān)于蛋白總的表達(dá)量問(wèn)題
研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。這有兩種方法,，一是：相同的樣品在不同的孔中上樣兩次（可在相同的膠上,，也可在不同的膠上），其一壓磷酸化蛋白,，另一壓該蛋白總的表達(dá)量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白）,，甚至還可跑另一個(gè)膠，壓內(nèi)標(biāo),。但是一般不建議如此做,，因?yàn)檫@樣比較時(shí)誤差還是較大的。因此,，比較常用的方法,，即用strip液將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去，然后用同一張膜壓總蛋白,。然后再洗脫一次,，再壓內(nèi)標(biāo)。
更多實(shí)驗(yàn)資訊可咨詢我司業(yè)務(wù)員,。上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司擁有自己的實(shí)驗(yàn)室,，備有專業(yè)的技術(shù)研發(fā)團(tuán)隊(duì)，長(zhǎng)期致力于各種生物試劑,，細(xì)胞,，血清，ELISA試劑盒的研發(fā)與銷售,，實(shí)驗(yàn)提供免費(fèi)代測(cè)服務(wù),，并提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù),，如果您有實(shí)驗(yàn)上的問(wèn)題歡迎前來(lái)咨詢，為您提供專業(yè)的一對(duì)一技術(shù)指導(dǎo),。