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在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應,，即加標本和加酶結(jié)合物后,。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間,，這一保溫過程稱為溫育,，有人稱之為孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當,。
ELISA屬固相免疫測定,，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié) 合的機會,，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點,。在其后加入的酶標記抗體與固相抗 原的結(jié)合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應 動力學研究時，實驗表明,，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1～2小時,，產(chǎn)物的生成可達。為加速反應,，可提高反應的溫度,，有些試驗在43℃進行,，但不宜 采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃更為*,，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成zui多的沉淀,。但因所需時間太長,，在ELISA試劑盒中一般不予 采用。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,，一般均采用水浴,，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面,，使溫度迅速平 衡,。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱,，ELISA試劑盒應放在濕盒內(nèi),，濕盒要選用傳 熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布,，zui后將ELISA板放在濕紗布上,。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此,。 無論是水浴還是濕盒溫育,，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應,，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指 20～25℃,，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育,。室溫溫育時，ELISA試劑盒只要平置于操作臺上即可,。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準 確,。為保證這一點，一個人操作時,，一次不宜多于兩塊板同時測定,。

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