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2023新版:ELISA實(shí)驗(yàn)的一些原理總結(jié)
閱讀：620 發(fā)布時(shí)間：2023-3-29ELISA 即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定,，是一類常用的免疫酶技術(shù),。主要方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,，然后利用酶標(biāo)記（偶聯(lián)）的抗體或抗原與之孵育,，加入顯色劑顯色,，通過酶標(biāo)儀測(cè)定待測(cè)物顏色與標(biāo)準(zhǔn)物顏色的差異，繪制出酶活曲線得出待測(cè)物濃度,。
一,、四種常見ELISA方法:
1.直接ELISA
將抗原固定于ELISA板上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測(cè)抗原,。相較于其它類型的ELISA實(shí)驗(yàn),，直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少，檢測(cè)速度快,，不需要用到二抗,，避免了交叉反應(yīng)，測(cè)定結(jié)果不容易出錯(cuò),。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的,，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會(huì)與ELISA板結(jié)合,，實(shí)驗(yàn)背景會(huì)比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗,，實(shí)驗(yàn)不太靈活,。另外由于沒有使用二抗，信號(hào)沒有被放大,，降低了測(cè)定的靈敏度,。
2.間接ELISA
先將抗原結(jié)合到ELISA板上，隨后分兩步進(jìn)行檢測(cè)：首先加入檢測(cè)抗體與抗原特異性結(jié)合,，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測(cè)并利用底物顯色,。與直接ELISA相比，間接ELISA用到酶標(biāo)二抗,，具有更高的靈敏度,，也需要更少的標(biāo)記抗體，更經(jīng)濟(jì),。間接ELISA還提供了更大的靈活性，因?yàn)椴煌囊豢鼓軌蚺c單一標(biāo)記的二抗一同使用,。間接ELISA實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是存在交叉反應(yīng)的可能性（酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合）,，可能會(huì)增加背景，同時(shí)與直接ELISA相比,，間接ELISA實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟,，實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)。
3.夾心ELISA
先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中,，然后加入樣品,，接著加入檢測(cè)抗體。如果檢測(cè)抗體是酶標(biāo)抗體,，則可稱為直接夾心ELISA,；如果檢測(cè)抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測(cè)抗體結(jié)合,，這種稱為間接夾心ELISA,。夾心ELISA的靈敏度高，它比直接或間接ELISA敏感2-5倍,；同時(shí)夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合,，擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進(jìn)行檢測(cè),，靈活性較高,。夾心ELISA的缺點(diǎn)是對(duì)配對(duì)抗體要求很高，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測(cè)試的配對(duì)抗體,，則需要進(jìn)行配對(duì)抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化,，因?yàn)榻档筒东@抗體與檢測(cè)抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的,。
4.競(jìng)爭(zhēng)ELISA法
預(yù)先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體,。實(shí)驗(yàn)時(shí),，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢物是抗原,，則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)抗體,；如果待檢測(cè)物是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被在固相載體上的抗原,。通過洗滌洗掉被競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的酶標(biāo)抗體,，后加底物顯色。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原（或抗體）的量成反比,。競(jìng)爭(zhēng)ELISA相對(duì)以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些,，但以上三種ELISA類型都適用于競(jìng)爭(zhēng)ELISA的形式。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可檢測(cè)不純的樣品,，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高,，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。
二,、ELISA常見問題與解決方法
1. 陰性對(duì)照出現(xiàn)陽性結(jié)果
① 樣品,、試劑被污染，或加樣時(shí)操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑,，小心操作,。
② 酶標(biāo)板洗滌不chedi——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒?jié)M板孔,，確保能充分洗滌,。
③ 抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當(dāng)濃度,。
2．酶標(biāo)板整體背景高
① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合,。
② 底物結(jié)合濃度過高——對(duì)底物進(jìn)行適當(dāng)稀釋。
③ 反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)——當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時(shí)立即使用終止液終止反應(yīng),，適當(dāng)縮短顯色時(shí)間,。
④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的，若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染,，應(yīng)更換新的底物溶液,。
⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。
3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差
① 樣品數(shù)量不整齊,，加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短——加重復(fù)孔時(shí)盡量保持加樣時(shí)間與第一次接近,。
② 加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，并且使用同一移液槍,。
③ 洗滌條件,、操作人員不一致——重復(fù)測(cè)定樣品時(shí),，操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致,。
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