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2022ELISA實驗攻略大全
閱讀：1111 發(fā)布時間：2022-9-13為了幫助科研初學者快速上手，減少實驗摸索的苦惱,，我們專門整理了這篇干貨,，為大家詳細介紹ELISA實驗流程和一些注意事項，一起來看看吧！
一,、ELISA操作前準備工作
試劑盒的選擇：ELISA操作前,，應(yīng)做好實驗的設(shè)計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒,，如恒遠生物高敏ELISA，提前訂購和準備試劑及耗材,、處理樣本等準備工作,。
樣本處理：在收集標本前需有一個完整的計劃，需要清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定,。ELISA檢測提倡新鮮標本盡早檢測,，對收集后當天就進行檢測的標本，及時儲存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集標本,，請取材后，將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存,。因冰室與室溫存在一定溫差,，蛋白極易降解，直接影響實驗質(zhì)量,，所以避免反復(fù)凍融,。
二、ELISA標準品溶解
標準品是試劑盒的檢測抗原的一個度量標尺,，因此標準品的溶解,、倍比稀釋和保存要特別注意以下細節(jié)：凍干標準品溶解按照說明書的要求，準確復(fù)溶,。在冰上操作標準品為佳,，靜止5-10分鐘，輕輕搖勻后按照一次量分裝,，在-20度或-70度保存,。標準品嚴禁反復(fù)凍融。標準品的倍比稀釋應(yīng)事先做好準備,，如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備;稀釋時,，應(yīng)充分混勻;采用進口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附,。在實驗孔內(nèi)進行倍比稀釋時,，注意操作規(guī)范，槍頭勿刮劃預(yù)包被的孔底,。
三,、ELISA操作中的洗滌
洗滌是ELISA實驗中是多次數(shù)的操作，也是非常重要的步驟,。不嚴格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象,，實驗重復(fù)效果差的現(xiàn)象,。不管用多道加樣器、洗瓶,、吸管,，還是洗板機，嚴格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積,、洗滌時間和洗滌次數(shù),。注意標準化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。
a)洗液不要溢出孔外,，以免污染相鄰的孔,，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔,，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,，背景肯定會增高。
b)特別注意：設(shè)計實驗的時候要考慮實驗孔的位置,，保證甩掉洗液時,，空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側(cè)或分開好,。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(zhuǎn)(從正上方旋轉(zhuǎn)120-150度)要迅速,、干脆。甩板不要手腕左右搖擺,、旋轉(zhuǎn)來甩液體!甩出后以直線方式補2-3次甩出液體,。
c)用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙,，因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底,，導致洗板不干凈，結(jié)果偏高或偏低,，重復(fù)孔的數(shù)值也會相差很大,。
d)每次拍板不要重復(fù)在一個地方拍，特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕,，否則拍不干凈,，拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重,，以至把板條給拍斷,。每次洗板后輕叩幾下，后一次一定要扣干凈,。
e)不能減少洗液體積,、洗板時間和次數(shù)。洗板時間太短，洗板效果不佳,。延長洗板時間和增加洗板次數(shù)可以使背景更干凈,。
四、ELISA的標準曲線如何擬合?
一般情況按照說明書推薦方法擬合標準曲線,。標準曲線可以由酶標儀附帶軟件自動生成,，也可手動制作。標準曲線呈“S"形曲線,，兩端趨于水平,，中間趨于線性，中間部分為較佳的檢測范圍,。當標準品的量超過與包被抗體結(jié)合的量，此時標準品已飽和,，再增加標準品的量,，其OD值不再變化，故當標準品達到一定濃度后,，曲線就趨于水平,。一般給出的濃度范圍落在中間線性范圍，根據(jù)標準曲線,，可以測出樣本的濃度,。按照科學分析方法，如果存在“奇異點"或者“污點",，直接采用線性分析不是很好,，要對擬合標準曲線的幾個點進行取舍，同時也可改用雙對數(shù)直線擬合或者四因素曲線擬合,。
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