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ELISA實驗成功秘笈
閱讀：1543 發(fā)布時間：2021-8-5很多人第一次做ELISA實驗,，覺得真簡單,，無非就是加樣，保溫,，洗滌等操作步驟,。可是第二次做ELISA實驗,，實驗結(jié)果怎么差那么多,？同一份樣本怎么可能呢？第三次做ELISA,，決定認真一些,，實驗結(jié)果還是不盡人意，誒,，也太難了,！今天小編就給大家總結(jié)一下ELISA實驗要點，掌握這些,，實驗So easy,！
ELISA實驗操作注意要點
一、加樣
在 ELISA 中除了包被外,，一般需進行 4－5 次加樣,。在定性測定中有時不強調(diào)加樣量的準確性，例如規(guī)定為加樣一滴,。此時應(yīng)該使用相同口徑的滴管,，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同,。在定量測定中則加樣量應(yīng)力求準確,。標本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制。加樣時應(yīng)將液體加在孔底,，避免加在孔壁上部,，并注意不可出現(xiàn)氣泡。
1. 吸取樣品時,，加樣槍吸頭不應(yīng)黏附多余的液體,；加樣時不可90度向孔中滴加液體，這樣會導(dǎo)致液體殘留在吸頭上,，加樣不準確！
2. 不要將吸頭伸入孔中,，一方面若接觸孔底可能壓彎吸頭,，另一方面可能會將孔中的液體吹起來，加樣不準確,！
3.正確的加樣方法應(yīng)為45度,，吸頭貼著孔壁加入,，應(yīng)注意：
①角度太小，會使液體殘留在孔壁上,，導(dǎo)致加樣不準確,！
②吸頭應(yīng)當(dāng)貼著管壁和液面的交界處！
二,、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間,，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育,。
ELISA屬固相免疫測定,，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會,，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點,。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。
在 ELISA 中一般有二次抗原抗體反應(yīng),，即加標本后和加結(jié)合物后,，此時反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器好是水浴箱,，可使溫度迅速平衡,。各 ELISA 板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的,，傳熱容易,。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中,，以平衡溫度,，這在室溫較低時更為重要。加入底物后,，反應(yīng)的時間和溫度通常不做嚴格要求,。如室溫高于 20℃,，ELISA 板可避光放在實驗臺上，以便不時觀察,，待對照管顯色適當(dāng)時,，即可終止酶反應(yīng)。
三,、洗滌
洗滌在 ELISA 過程中不是反應(yīng)聚,，但卻是決定實驗成敗的關(guān)鍵。洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的,。因此在 ELISA 測定的反應(yīng)過程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,。在標本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫,，Tween）一類物質(zhì)即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯,，為非離子型的表面張力物質(zhì),，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號,，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯 20,，在 ELISA 中為常用。它的洗滌效果好,，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結(jié)合的作用,。
洗滌如不*，特別在后一次,，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附,，將使空白值升高。另外,，在間接法中如血清標本內(nèi)的非特異性 IgG 吸附在固相上而未被洗凈,，也將與酶標抗體作用而產(chǎn)生干擾。
ELISA 板的洗滌一般可采用以下方法：
①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,；
②將洗滌液注滿板孔,；
③放置 2 min，略作搖動,；
④吸干孔內(nèi)液,，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為 3～4 次,，有時甚至需洗 5～6 次,。