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ELISA實驗成功秘笈
閱讀：1824 發(fā)布時間：2021-8-5很多人第一次做ELISA實驗，覺得真簡單,，無非就是加樣,，保溫，洗滌等操作步驟,?？墒堑诙巫鯡LISA實驗，實驗結(jié)果怎么差那么多,？同一份樣本怎么可能呢,？第三次做ELISA，決定認真一些,，實驗結(jié)果還是不盡人意,，誒，也太難了,！今天小編就給大家總結(jié)一下ELISA實驗要點，掌握這些,，實驗So easy,！
ELISA實驗操作注意要點
一、加樣
在 ELISA 中除了包被外，一般需進行 4－5 次加樣,。在定性測定中有時不強調(diào)加樣量的準確性,，例如規(guī)定為加樣一滴。此時應(yīng)該使用相同口徑的滴管,，保持準確的加樣姿勢,，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應(yīng)力求準確,。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制,。加樣時應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部,，并注意不可出現(xiàn)氣泡,。
1. 吸取樣品時，加樣槍吸頭不應(yīng)黏附多余的液體,；加樣時不可90度向孔中滴加液體,，這樣會導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準確,！
2. 不要將吸頭伸入孔中,，一方面若接觸孔底可能壓彎吸頭，另一方面可能會將孔中的液體吹起來,，加樣不準確,！
3.正確的加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁加入,，應(yīng)注意：
①角度太小,，會使液體殘留在孔壁上，導(dǎo)致加樣不準確,！
②吸頭應(yīng)當(dāng)貼著管壁和液面的交界處,！
二、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間,，這一保溫過程稱為溫育(incubation),，有人稱之為孵育。
ELISA屬固相免疫測定,，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標(biāo)本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會,，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點,。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育,。
在 ELISA 中一般有二次抗原抗體反應(yīng),，即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，此時反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求,，保溫容器好是水浴箱,，可使溫度迅速平衡。各 ELISA 板不應(yīng)疊在一起,。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中,。濕盒應(yīng)該是金屬的,，傳熱容易。如用保溫箱,，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中,，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要,。加入底物后,，反應(yīng)的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于 20℃,，ELISA 板可避光放在實驗臺上,，以便不時觀察，待對照管顯色適當(dāng)時,，即可終止酶反應(yīng),。
三、洗滌
洗滌在 ELISA 過程中不是反應(yīng)聚,，但卻是決定實驗成敗的關(guān)鍵,。洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的,。因此在 ELISA 測定的反應(yīng)過程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附,，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫,，Tween）一類物質(zhì)即右達到此目的,。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì),，常作為助溶劑,。根據(jù)脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號,，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯 20，在 ELISA 中為常用,。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結(jié)合的作用,。
洗滌如不*,，特別在后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附,，將使空白值升高,。另外，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性 IgG 吸附在固相上而未被洗凈,，也將與酶標(biāo)抗體作用而產(chǎn)生干擾,。
ELISA 板的洗滌一般可采用以下方法：
①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；
②將洗滌液注滿板孔,；
③放置 2 min,，略作搖動；
④吸干孔內(nèi)液,，也可傾去液體后在吸水紙上拍干,。洗滌的次數(shù)一般為 3～4 次，有時甚至需洗 5～6 次,。