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開(kāi)學(xué)了,ELISA實(shí)驗(yàn)開(kāi)始咯
閱讀：1922 發(fā)布時(shí)間：2021-2-25開(kāi)學(xué)了,，過(guò)了一個(gè)寒假,，ELISA實(shí)驗(yàn)操作還記得吧,，今天恒遠(yuǎn)生物就帶大家一起來(lái)回顧下ELISA實(shí)驗(yàn)的疑難點(diǎn),！
實(shí)驗(yàn)原理
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí),，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上,。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢
物質(zhì)的量呈一定的比例,。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
實(shí)驗(yàn)流程
夾心法ELISA：
1.加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中,，每個(gè)濃度的工作液并列加兩孔,，每孔100 μL。待測(cè)樣品加入到其他孔,，每孔100 μL(若樣本濃度高于檢測(cè)范圍,，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。給酶標(biāo)板覆膜,，37℃孵育90分鐘,。提示：加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)間宜控制在10分鐘內(nèi),。
2.生物素化抗體/抗原：棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每個(gè)孔中立即加入生物素化抗體/抗原工作液100 μL，混勻,，酶標(biāo)板加上覆膜,，37℃孵育1小時(shí)。
3.洗滌：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加洗滌液350 μL,，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,，在厚的吸水紙上拍干,。重復(fù)此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機(jī),。每一步洗滌充分是實(shí)驗(yàn)的根本,。
4.HRP酶結(jié)合物：每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻，加上覆膜,，37℃孵育30分鐘,。
5.洗滌：棄去孔內(nèi)液體，洗板5次,，方法同步驟3,。
6.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻,，加上覆膜,，37℃避光孵育15分鐘左右。提示：根據(jù)實(shí)際顯色問(wèn)題酌情縮短或延長(zhǎng)孵育時(shí)間,，但不可超過(guò)30分鐘,。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止,。
7.終止：每孔加終止液50 μL,，終止反應(yīng)。提示：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同,。
8.讀值：立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值),。應(yīng)提前打開(kāi)酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置好檢測(cè)程序,。
9.實(shí)驗(yàn)完畢后,，將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質(zhì)期。
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA：
1.加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中,，每個(gè)濃度的工作液并列加兩孔,，每孔50 μL。待測(cè)樣品加入到其他孔,，每孔50 μL(若樣本濃度高于檢測(cè)范圍,，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。立即每孔加入配好的
生物素化抗體工作液50 μL,?；靹颍o酶標(biāo)板覆膜,，37℃孵育45分鐘,。提示：加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)間宜控制在10分鐘內(nèi),。
2.洗滌：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加洗滌液350 μL,，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,，在厚的吸水紙上拍干,。重復(fù)此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機(jī),。每一步洗滌充分是實(shí)驗(yàn)的根本,。
3.HRP酶結(jié)合物：每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻,，加上覆膜,，37℃孵育30分鐘。
4.洗滌：棄去孔內(nèi)液體,，洗板5次,，方法同步驟2。
5.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL,，混勻,，加上覆膜，37℃避光孵育15分鐘左右,。提示：根據(jù)實(shí)際顯色酌情縮短或延長(zhǎng)孵育時(shí)間,，但不可超過(guò)30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí),，即可終止,。
6.終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng),。提示：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同,。
7.讀值：立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。應(yīng)提前打開(kāi)酶標(biāo)儀預(yù)熱,，設(shè)置好檢測(cè)程序,。
8.實(shí)驗(yàn)完畢后，將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質(zhì)期,。
恒遠(yuǎn)生物十幾年來(lái)一直致力于生物科研領(lǐng)域,，提供全面的、創(chuàng)新的,、優(yōu)質(zhì)的、便捷的科研產(chǎn)品和服務(wù),。目前,，其自主研發(fā)的重組蛋白、抗體,、ELISA檢測(cè)試劑盒得到廣大科研用戶的認(rèn)可,，并且多次發(fā)表于期刊,，進(jìn)一步推動(dòng)了民族品牌化的傳播。