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細(xì)胞培養(yǎng)?咋培養(yǎng)?
閱讀：1548 發(fā)布時(shí)間：2020-8-25細(xì)胞培養(yǎng)，看似簡(jiǎn)單的一個(gè)實(shí)驗(yàn)，卻不知道把多少英雄豪杰折磨的意欲“自掛東南枝”。今天恒遠(yuǎn)生物就為大家盤(pán)整理出了一篇養(yǎng)細(xì)胞的注意事項(xiàng),，養(yǎng)細(xì)胞可不同于養(yǎng)閨女，稍微磕磕碰碰,，一切就重新來(lái)過(guò),！希望廣大科研汪能與細(xì)胞愉快的玩耍呦！
（一）冷凍管應(yīng)如何解凍
取出冷凍管后,，須立即放入 37 ℃ 水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿,，否則易發(fā)生污染情形,。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全,，預(yù)防冷凍管的爆裂,。
（二）細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，DMSO如何處理
在細(xì)胞解凍之后,，可直接離心去除DMSO,，用新鮮的培養(yǎng)基懸浮后直接放入含有 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，如此可避免解凍后細(xì)胞生長(zhǎng)受到DMSO影響,。
（三）可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基
每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基,，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基,，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng),，造成細(xì)胞無(wú)法存活，不應(yīng)該馬上替換,。
（四）可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類(lèi)
血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,，所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生影響。來(lái)自不同物種的血清,，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。
（五）何謂 FBS,，F(xiàn)CS,，CS,，HS
FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清,。CS （calf serum） 則是指小牛血清,。HS （horseserum） 則是指馬血清。
（六）培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用 5% 或 10% CO2
一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng),，而培養(yǎng)基中 NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO2 濃度,。理論當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10% CO2,；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 1.5 g 時(shí),，則應(yīng)使用 5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。
（七）何時(shí)須更換培養(yǎng)基,。培養(yǎng)基中是否須添加抗生素,。
視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間,，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可,。
一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中可以添加抗生素,。 按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL。
(八）貼壁細(xì)胞傳代時(shí)所使用的trypsin-EDTA濃度及相應(yīng)處理
一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為0.25%trypsin-0.53mMEDTA.4Na,。*開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,，保存于–20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin的活性降低,，并可減少污染的機(jī)會(huì),。
（九）將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，離心速率多少
回收動(dòng)物細(xì)胞,，其離心速率一般為1000 rpm,，5-10 分鐘，過(guò)高的轉(zhuǎn)速,，將造成細(xì)胞死亡,。
（十）細(xì)胞的接種密度
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤(pán)的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的重要原因之一,。
（十一）細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成分及DMSO的等級(jí)
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5-10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合,。注意：由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中,，必須使用前先行配制完成,。冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí)，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ,，其本身即為無(wú)菌狀況,，首次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中避光保存,。
（十二）冷凍保存細(xì)胞的方法及冷凍細(xì)胞濃度
將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集,，以含有DMSO*培養(yǎng)基或胎牛血清的凍存液重懸細(xì)胞至終濃度約1x106/ml,。。以每管1～2ml分裝至凍存管中,。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過(guò)夜,。次日保存到液氮中。
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,，融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜,。
（十三）如何避免細(xì)胞污染
細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌、真菌,、霉菌,、病毒等。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng),、操作室環(huán)境不佳,、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格無(wú)菌操作技術(shù),、清潔的環(huán)境,、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染的方法。
（十四）支原體 （mycoplasma）污染的細(xì)胞,， 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響
不能以肉眼觀察出支原體污染異狀,。除極有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,，無(wú)法以其外觀分辨,。
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長(zhǎng)參數(shù)，代謝及研究任一數(shù)據(jù),。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,，必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義,。
（十五）培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,，顏色會(huì)偏暗紅色，且 pH 值會(huì)越來(lái)越偏堿性
培養(yǎng)基保存于4 ℃冰箱中,，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會(huì)逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅,。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡,。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),，可以通入無(wú)菌過(guò)濾 CO2 ,，以調(diào)整 pH 值?；蛩釅A調(diào)PH,。
（十六）L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎,？
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的,。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源,、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝,。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性,。
（十七）什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么,？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色,，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色,。由于酚紅干擾檢測(cè),，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基,。
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是,，如果沒(méi)有葡萄糖的話,，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
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