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ELISA操作有何難?
閱讀：1258 發(fā)布時間：2019-11-7ELISA具有敏感性高,、特異性強(qiáng),、操作簡單等優(yōu)點,，被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測定，為輔助臨床診斷與生物科研起到了積極的推動作用,。但ELISA測定中影響因素較多,，操作過程中每個環(huán)節(jié)都會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響，出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
試劑的因素
試劑的選擇：試劑的選擇是保證血液檢測質(zhì)量的關(guān)鍵要素,。雖然國家采用批批檢定的形式對ELISA試劑嚴(yán)格把關(guān)，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異,。要選購度相對高,、具有“三證”的試劑，不要用無批號的試劑,，選用與儀器配套的試劑,。更不要使用過期的試劑和混用不同批號的試劑。
操作中的因素
加樣：孵育前加樣時間過長,，酶試劑加出孔外,，使用滴瓶滴加試劑時，滴加的角度不同和擠壓的力度不同,，致使滴加的試劑量不準(zhǔn),，都可導(dǎo)致試驗結(jié)果不準(zhǔn)確。
控制方法：
①實驗樣本過多時,，可分批次操作,，以減少實驗時間延長造成的誤差；
②加酶試劑后,，用吸水紙吸干孔外試劑,；
③作定量試驗時，使用加樣器加注試劑,，并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性,，此外，要做到一份樣本一個移液頭,，防止交叉污染,。
溫育：溫育是ELISA測定為關(guān)鍵、容易出現(xiàn)問題的步驟,。為常見的溫育溫度有37℃和室溫,，其次是43℃和2-8℃。目前國內(nèi)售ELISA試劑盒溫育時間為37℃,，30 min-1 h,，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃,，1-2 h能有較*的結(jié)合。
溫育時間,、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時間,、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時,，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時間,，如果是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠,，易致弱陽性標(biāo)本測不出來,。
控制方法：
①如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度,、較長反應(yīng)時間的條件,；
②用1個小溫度計放置在板孔反應(yīng)液中測量觀察。
“邊緣效應(yīng)”的排除“邊緣效應(yīng)”是在使用96孔板的ELISA測定中,，外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的,，因此在溫育時盡量采用水浴,。
洗板：ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板,。采用手工洗板,，孔與孔之間液體易交叉，采用半自動洗板機(jī)時,，洗液量不足導(dǎo)致洗板不*,，洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不*，洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差,。
控制方法：
①手工洗板時,，拍板時要垂直，避免交叉污染,，用力不能過猛,，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；
②洗板機(jī)洗板時應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢,，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出,；
③為了洗滌效果好，實驗室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次,，或適當(dāng)增加洗板的次數(shù)，有資料報道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果,。
顯色：市售ELISA試劑盒中,，如以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物,，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑,。顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑,，要臨用前30 min配制且必須避光,。以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光，但A,、B液應(yīng)盡量避免接觸金屬器械,。
結(jié)果判定：讀取結(jié)果要在15-30 min內(nèi)完成，定性測定用肉眼判讀試驗結(jié)果時,，反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景10-15 cm,；定量測定時用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，酶標(biāo)儀不應(yīng)置于陽光或強(qiáng)光照射下,，需先預(yù)熱15-30 min再進(jìn)行測試,。
綜上所述，盡管ELISA法操作簡單,，但可能影響測定結(jié)果的因素也較多,。故在實際操作的過程中，要加強(qiáng)質(zhì)量管理,，認(rèn)真避免或減少影響因素,，力求結(jié)果準(zhǔn)確，為疾病的診斷和科研提供可靠的依據(jù),。