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   非內(nèi)源性蛋白的相互作用,， 主要是通過(guò)過(guò)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，通常為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn),、提高 IP 效率會(huì)讓外源蛋白帶上標(biāo)簽,。因此，就 tag 的使用而言存在很多小技巧,。
1,、 His-tagged主要用于純化蛋白。有些人喜歡用His-tagged蛋白然后進(jìn)行coIP,，實(shí)際上它存在潛在的隱患,。因?yàn)楹芏嗟鞍讜?huì)有富含histidine的domain,，恰恰是因?yàn)樾r(jià)非常好，所以很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識(shí)別,。同理,，如果用Ni-NTA beads去PD（pull down） His-tagged的蛋白，*有可能 PD 那些內(nèi)源性的富含histidine domain的蛋白,，造成coIP的假象,，而這樣的蛋白還非常多。
2,、tandem-tagged不能用于分析鈣調(diào)信號(hào)通路,。tandem tag實(shí)際上從成本角度和His tag差不多，洗脫試劑價(jià)格低廉,，因此可用于大規(guī)模PD之后的質(zhì)譜分析,，能獲取zui全面的相互作用的信息。然而由于其中包含鈣調(diào)蛋白相互作用domain,，天然會(huì)結(jié)合鈣信號(hào)相關(guān)蛋白,，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號(hào)蛋白之間的相互作用，有一定的應(yīng)用局限,。
3,、Myc、HA,、Flag-tagged： Myc仍然會(huì)有天然的干擾,，應(yīng)用略有局限,；相較后兩者是人工合成專門用于tagged蛋白,，因此干擾zui小、zui常用,。如需進(jìn)一步細(xì)致區(qū)分,，a-Flag效價(jià)比a-HA略高，因此更適合IP,。

                        
4,、tag的位置。將tag構(gòu)建到蛋白的 N 端還是C端,，也是一個(gè)潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素,。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信號(hào)肽,，如果將tag構(gòu)建 到N端,，則外泌時(shí)會(huì)被信號(hào)肽酶連同信號(hào)肽一起切除；所以這時(shí)必須構(gòu)建在C端,。再如,，多數(shù)蛋白的 C 端是疏水區(qū),，有的時(shí)候?qū)?tag 構(gòu)建在 C 端會(huì)影響蛋白原來(lái)的空間結(jié)構(gòu)，如恰好 C 端同時(shí)是相互作用的結(jié)構(gòu)域,，某些時(shí)候還可能被遮 蔽,，從而干擾相互作用。因此,，通常構(gòu)建質(zhì)粒的時(shí)候是 N 端,、C 端 tagged 同時(shí)分別構(gòu)建，以備萬(wàn)一,。
5,、 IP 外源 tagged-A 蛋白，洗脫盡量用相應(yīng)的 多肽,，一方面提高特異性,，另 一方面由于洗脫條件溫和，重鏈和輕鏈脫落也會(huì)較少,； 在 IP 前,， 尤其對(duì)于新 Flag、 HA beads 可以用 washing buffer 或者低 pH Glycine-HCl 漂洗一下 beads,， 把結(jié)合不牢的重鏈和輕鏈先洗掉,。此外，F(xiàn)lag,、HA-beads 通常是鼠抗,，那么 IB B 蛋白的抗體應(yīng)該選用兔抗。
6,、 IP 內(nèi)源性蛋白,，尤其zui后涉及低 pH Glycine-HCl 洗脫或者 SDS LB 煮 beads （后者重、輕鏈更嚴(yán)重）,，如 B 蛋白為 60KDa 即能與 55KDa 重鏈分開時(shí),，且抗體效價(jià)許可的前提下，降低抗體投入量會(huì)顯著減弱重,、輕鏈信號(hào),，從而不會(huì)使得 B 蛋白信號(hào)不致被重鏈信號(hào)吞沒(méi)； 若有條件再配合交錯(cuò)抗體種屬來(lái)源,， 即 IP A 蛋白的抗體為兔抗,，IB B 蛋白用兔抗以外任何一種諸如鼠抗、羊抗,；反之亦然,。
7、即使交錯(cuò)抗體的種屬，實(shí)際上當(dāng)重輕鏈脫落過(guò)多時(shí)（尤其是重鏈）,，在 IP 的時(shí)候它符合《WB 實(shí)戰(zhàn)指南》提到的雜蛋白過(guò)濃會(huì)非特異結(jié)合任意抗體,，這在 coIP 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析中要格外小心。有人會(huì)說(shuō)可以用未免疫的 IgG 做陰性對(duì)照,，但 是偶爾會(huì)發(fā)生一些未知意外,，恰好 IgG 的重鏈沒(méi)有顯影（畢竟這不是抗原抗體 特異性結(jié)合）。
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