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   DNA中加上酶,，然后保溫一段時間就可以了,。但是在實際操作過程中，我們不斷聽到：切不動,，裝不上,。問題在什么地方?對此,，您可以懷疑酶的質(zhì)量問題,，但是更多的問題來源于模板是否合適酶切要求。今天上海恒遠(yuǎn)生物將為您帶來點干貨：酶切切不動,裝不上,該咋辦?
1.成功酶切的關(guān)鍵是準(zhǔn)備好模板DNA,。DNA樣品中不能含有有機溶劑(會使酶變性或產(chǎn)生星號貨性),，不能含有干擾酶活性的污染物質(zhì)，不能含有高濃度的 EDTA (TE中的EDTA濃度較低,，對Mg的濃度影響較小),；同時要對DNA甲基化程度及其對酶切效率的影響要做到心中有數(shù)。
2.選用合適的酶,。根據(jù)酶切序列選用,，特別注意選用甲基化對酶活性的干擾。
3.正確使用和保存酶,。酶需要保存在-20度的低溫環(huán)境中,，只是在需要用酶才從冰箱中取出來。運輸和臨時存放時需要將酶至于冰上,。手拿酶管時不要接觸酶管下步含酶的部分,，移酶時盡可能用長tip, 避免污染。用完后需要及時送回原處,。注意：酶通常是zui后加,。
4.反應(yīng)體積需要根據(jù)實驗?zāi)康亩ǎＲ?guī)的酶切一般要維持在10-50ul,，酶切鑒定10-20ul就可以了,。
5.模板濃度問題：濃度過高，溶液黏度過大，酶不能有效擴散,，酶切效果不會好,。濃度過低，也會影響酶活性,。
6.注意模板用量和反應(yīng)體積的關(guān)系,。對酶用量，模板用量,，反應(yīng)體積等要素的確定需要的是時間和經(jīng)驗的積累,。
7.酶切反應(yīng)的各個組分加完后，需要用TIP小心混勻幾次,，short spin 一下就可以保溫了,。一般不能使用振蕩器混勻。
8.反應(yīng)溫度的選擇,。一般反應(yīng)都用37度,，但是 Sma I 的溫度是25度，37度時酶仍表現(xiàn)出活性,，但是效率下降50%,。部分從耐熱菌制備的酶需要在37度以上的溫度反應(yīng)，如taq I的zui適溫度為65度,，37度保溫,，效率僅為前者的1/10。
9.反應(yīng)時間的選擇,。一般酶切鑒定30分鐘就可以了,。要*酶切可以采用少量的酶長時間反應(yīng)，或較高的酶量短時間處理都可以達到,。在使用高酶量的時候需要注意甘油的zui終濃度不要超過5%,，也就是說10ul的體系，酶的用量不要超過1ul,。
10.是否和如何終止反應(yīng)?酶切鑒定之類的實驗不需要特殊處理,。滅活的手段：加入高濃度的EDTA;65度或80度熱處理20-30分鐘;部分從高溫菌純化出來的內(nèi)切酶由于zui適的反應(yīng)溫度比較高，熱處理滅活不一定*,，需要用苯酚/氯fang/yi醇方法純化;電泳回收也是實驗室常用除酶的手段,。

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