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新客戶一：我用TMB顯色15min后，加入2M硫酸100ul終止反應,，然后讀數,。發(fā)現加入陽性血清的OD值不穩(wěn)定，呈上漲的趨勢,，同時陰性和空白卻穩(wěn)定,，這是什么原因呢？
上海恒遠：這說明沒有終止*,，降低TMB的用量,。一般情況下是不會漲太多的。

新客戶二：我用夾心法ELISA測細胞因子, 檢測標準抗原敏感性只能到 ng/ml水平,我應該從那些方面著手來提高敏感性呢?
上海恒遠：如果單用雙抗體夾心法測細胞因子,，ELISA靈敏度能到1ng上下,，這是方法學決定的。有三種方法可以提高靈敏度：一是用發(fā)光法或熒光法,，有一種發(fā)光底物可直接替代TMB,，效果明顯；二是用生物素親和素放大,，三是用抗抗體法即包被抗體－細胞因子－單抗－抗鼠抗體接酶,。zui后一種可以提高靈敏度到0.05ng。

新客戶三：我看別人洗板時,，用500ml瓶接輸液器直接滴滿,，然后倒掉，洗板,，會不會因為滿了滴到其他孔,，造成相互干擾。3％BSA不能高壓,，用蒸餾水稀釋溶解后需要過濾嗎,？我的預實驗先用方正棋盤法一次摸索一抗，二抗的濃度,，而HRP-Avidin先用他的說明書：1：10000 或1：5000可以嗎,？再次預實驗則固定一抗,，二抗?jié)舛?，HRP-Aaidin濃度作一系列稀釋，確定HRP-Aaidin濃度,，對嗎,？陽性陰性值怎么確定,？有的用S/P>=2.1,或大于陰性對照OD值的2.1倍，或陰性對照OD值+-2SD,，到底那個對,？我是雙抗體夾心測抗原，無標準品,。謝謝,！

上海恒遠：1）如果這樣洗板的話，只要*次先把孔內液體甩去,，再加洗滌液即可,，不容易互相干擾的。zui后所有孔全部加滿后,，放置30-60秒再甩去,，這樣洗滌的更*。
2）BSA溶解后基本不用過濾,，除非您的BSA質量不好,。
3）沒有標準品，那您有沒有一些基本的標本,，或者自己用純化抗原稀釋的質控品,。您必須先對您的試劑定一個要求，比如說您希望將該抗原 1ng/ml測到0.2,，那您就自制一個質控品,，2ng/ml或5ng/ml都行，對應當OD就是0.4或1.0,。陰性就用您被測的陰性血清,。用質控品和陰性血清來摸索濃度，盡量把陽性質控品做高,，陰性血清值做低,。您摸濃度的過程基本可以，可以試試,。
4）臨界值的制定方法有很多,，一般市面上定為大于陰性對照OD值的2.1倍的其實都是定值：0.105。因為如果陰性對照小于0.05的話按0.05計算,。也有陰性對照加定值的（可以加0.1也可以加0.2）,，還有用陽性對照乘以定值的。這些都可以,，關鍵看您的系統做陰性血清可以達到多少的值,，和您的zui低靈敏度的值可以到多少。

 

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