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上海恒遠(yuǎn)提供免疫印跡技術(shù)服務(wù)
閱讀：1309 發(fā)布時(shí)間：2013-5-7免疫印跡技術(shù)服務(wù)（western blot）
免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（western blot），它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù),。由于免疫印跡（western blot）具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性,，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù),。免疫印跡（western blot）常用于鑒定某種蛋白,，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
閃晶生物為您提供全套免疫印跡（western blot）技術(shù)服務(wù)和相關(guān)的試劑耗材,。主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：
- 蛋白質(zhì)抽提
- 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品,，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）,，勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）,。
- 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品（細(xì)胞培養(yǎng)），每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞,，PBS清洗細(xì)胞,，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。
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2. 蛋白質(zhì)定量：按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作,，測(cè)定樣品濃度,。
3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳（SDS-PAGE）:將準(zhǔn)備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)*個(gè)孔中,，電泳分離蛋白,。
4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層,，30mA恒流條件下,，4°C轉(zhuǎn)移過夜,。
5. western blot膜的封閉和抗體孵育
- 膜在5％脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。
- 封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5小時(shí),，抗原抗體結(jié)合,。
- 加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜1小時(shí),。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時(shí)檢測(cè)GAPDH含量,。
6. western blot結(jié)果檢測(cè)：化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育,，經(jīng)X膠片曝光顯影,。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化,。
7. western blot數(shù)據(jù)分析：目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差,，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。
8. 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告,，包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù),。
更詳細(xì)的操作說明
請(qǐng)：
western blot費(fèi)用：每張膜上做一種目的蛋白和相應(yīng)的內(nèi)參蛋白。每張膜上可以做8個(gè)樣品,。每張膜的費(fèi)用是：1500.00元,。一抗另計(jì)，其它試劑免費(fèi),，一抗訂購時(shí)間約為1周,。