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恒遠總結(jié)人胎球蛋白A實驗全過程詳解
閱讀：2283 發(fā)布時間：2013-3-6
人胎球蛋白A檢測試劑盒實驗全過程詳解
預期用途
此試劑盒可用于血清,，血漿,，細胞上清,，組織提取物和尿液中人胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白的定量的檢測,；血清或血漿中胎球蛋白A的檢測可作為某些癌癥及基因遺傳缺陷的血清蛋白診斷的輔助工具,；此試劑盒僅供實驗室專業(yè)人士使用
簡介
胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白,，是由兩個氨基末端抑制域和一個較小的羧基末端域組成的59kDa分子量的糖蛋白,；由肝臟合成，分泌至血流,，成年哺乳動物體內(nèi)的濃度范圍在0.5-1.0g/L,；嬰兒期的血清胎球蛋白A含量高，參與蛋白酶抑制活性,，與鈣代謝和骨調(diào)節(jié)相關(guān),；累積于骨和牙齒內(nèi)，作為生物學上非膠原骨蛋白的主要部分,，研究表明,，胎球蛋白A是循環(huán)中主要的鈣化抑制劑；干涉鈣鹽沉淀,；近期研究顯示低水平胎球蛋白A的慢性腎臟衰竭患者與心血管病的高死亡率顯著相關(guān),；另一方面,，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，這是獨立于胰島素抑制劑的其他標記物,；另外,，高胎球蛋白A水平還可作為心血管疾病的的危險標記物
實驗原理
此試劑盒可用于血清樣本中人胎球蛋白A的定量檢測；采用雙位點夾心法,，羊抗人胎球蛋白A多抗結(jié)合人胎球蛋白A的不同位點
將含人胎球蛋白A的試驗標準品,，質(zhì)控品和預稀釋樣本加至包被了高度親和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔內(nèi)，*次孵育,，包被抗體捕獲樣本中的人胎球蛋白A,，未結(jié)合的蛋白洗板除去，然后加入HRP標記的抗人胎球蛋白A酶聯(lián)物加入至每孔,，“夾心-人胎球蛋白A-HRP-標記的酶聯(lián)物”形成夾心,，未結(jié)合的示蹤抗體通過洗板除去，結(jié)合于包被板上的HRP酶免物與底物液定時反應,，然后在酶標儀上檢測,；結(jié)合于包被胎球蛋白A上示蹤抗體酶活性與樣本中胎球蛋白A的含量直接相關(guān)，在點對點或三次回歸模式下以標準品的濃度比上OD值繪制標準曲線,，樣本中的胎球蛋白A可直接從標準曲線上得到
試劑：準備與貯存
此試劑盒收到后立即貯存于2-8℃下,，效期見試劑盒標簽；所有成分在2-8℃下可保存至有效期
使用前,，所有試劑平衡至室溫,，不同批次的試劑不能交換使用
包被板，96孔,，包被了抗人胎球蛋白A抗體,；微孔板固定于板架上，密封于含有干燥劑的鋁箔密封袋內(nèi),；貯存于2-8℃至有效期
胎球蛋白A示蹤抗體,，1瓶，0.6ml,，濃縮,，HRP標記的抗人胎球蛋白A示蹤抗體溶于穩(wěn)定的蛋白基質(zhì)中；此試劑使用前需用示蹤劑抗體稀釋液進行稀釋,；貯存于2-8℃至有效期
示蹤抗體稀釋液,，1瓶，11ml,，即用,，Trizma鹽酸溶于緩沖液；根據(jù)實驗步驟用于示蹤抗體稀釋,；貯存于2-8℃至有效期
試驗緩沖液,，濃縮,，1瓶，11ml,，含牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽,；建議使用前以1:10比例用雙蒸水稀釋（如11ml濃縮+99ml的雙蒸水）；貯存于2-8℃至有效期
洗滌液,，濃縮，1瓶,，20ml,，30倍濃縮；試驗前需用580ml的雙蒸水稀釋,，混勻,；一旦稀釋，不含疊氮化物防腐劑的磷酸緩沖鹽洗滌液會含表面活性劑,；稀釋的洗滌液在室溫下可保存至效期
HRP底物液,；1瓶，12ml,，含過氧化氫的TMB底物液,；貯存于2-8℃至有效期
終止液，1瓶,，12ml,，0.5M硫酸，貯存于2-8℃至有效期
胎球蛋白A標準品,，5瓶,，含胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態(tài)牛血清基質(zhì),；各標準品濃度見瓶子標簽,；3次凍存周期使用后，所有標準品保存至-20℃或更低
胎球蛋白A質(zhì)控,，2瓶,，含人胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態(tài)牛血清基質(zhì),，各質(zhì)控的濃度范圍見瓶子標簽,，3次凍存周期使用后質(zhì)控保存至-20℃或更低
安全注意事項
此試劑用于臨床參考實驗室，僅供醫(yī)生或?qū)嶒炇覍I(yè)人士體外診斷用
若試劑是有潛在感染風險的,，試驗操作和處理時應戴手套
避免接觸含TMB,，過氧化氫，硫酸的試劑,，TM,B會刺激皮膚和粘膜,，導致皮膚過敏反應,；TMB還可能是致癌物質(zhì)；皮膚接觸到硫酸會導致嚴重灼傷,，不要接觸到眼睛,，皮膚，衣服,，不要吸入煙霧,，一旦接觸，應立即用大量水沖洗至少15min
良好實驗室操作規(guī)范
實驗所需材料但試劑盒未提供
的單通道移液器,，10-25-100-1000ul
適于100ul的可重復用分液器
適于所有體積的一次性槍頭
一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm
帶蓋的一次性塑料瓶,；100-1000ml
鋁箔紙
雙蒸水或去離子水
塑料蓋板或聚乙烯薄膜
多通道洗滌瓶或全自動（半自動）洗板系統(tǒng)
酶標儀，450nm
樣本采集
人胎球蛋白A的檢測所需血清或血漿樣本量僅10ul
個人在采樣前無需特殊準備,，全血采集,，室溫下立即凝集30min，然后離心分離出血清（850-1500xg10min）,。全血采集3小時內(nèi)需將血清從凝集中分離出來,，轉(zhuǎn)移至另一干凈試管；血清樣本可保存在-20℃或更低,，避免超過三次的凍融
建議采用24小時尿液來檢測尿液中的胎球蛋白A,；采集第二天早晨的尿液，排除采樣前剛進行劇烈運動的,，因腎功能不全導致多尿的,；由利尿藥引起的人體內(nèi)尿蛋白含量波動降低，可能與尿肌酸酐濃度相關(guān),；
細胞上清,，組織提取物則需進行試驗樣本的倍比稀釋；多個平行樣檢測得到更的試驗結(jié)果
實驗步驟
患者樣本的準備
患者血清或血漿樣本在檢測前需用試驗緩沖液進行1:10000的稀釋
以1A和1B標記兩個試管（12x75mm）
加1ml的試驗緩沖液至各試管（1A和1B）
加10ul的患者血清至1A試管,，混合（1:100）
從1A管內(nèi)吸取10ul已稀釋的樣本至1B試管,，混合（1:10000）
注意：建議采用/經(jīng)校準的移液器，稀釋過程小心操作,，得到更的結(jié)果,；建議采用多通道（Combitip）12.5ml的Eppendorf可重復移液器加1ml的試驗緩沖液，而不用50ml的槍頭
患者尿液樣本的實驗前用試驗緩沖液1:100的稀釋
以1標記一試管（12x75mm）
各管加1ml試驗緩沖液
加10ul患者尿液樣本至1管,，混合（1:100）
注意：若所得結(jié)果中樣本濃度高于5個標準品中的zui高標準品濃度,，則尿液樣本需進一步稀釋（如1:500），然后重新檢測
試劑準備
試驗前將所有試劑平衡至室溫,，不同批次的試劑不能混合使用
使用前,，試驗緩沖液（濃縮）及洗滌液（濃縮）需進行稀釋，配制成工作液；詳情請見“試劑”部分
試驗操作
將實驗所需板條固定于板架上,，標準品,，質(zhì)控品及未知樣本做雙孔檢測
試驗布局
ROWSTRIP1STRIP2STRIP3
ASTD1STD5SAMPLE2
BSTD1STD5SAMPLE2
CSTD2C1SAMPLE3
DSTD2C1SAMPLE3
ESTD3C2
FSTD3C2
GSTD4SAMPLE1
HSTD4SAMPLE1
加25ul的標準品，質(zhì)控品及預稀釋的1:10000樣本至相應孔內(nèi),；注意：尿液樣本是1:100的稀釋
每孔加100ul的試驗緩沖液
混勻,，蓋板，避免暴露于陽光下
室溫下孵育2小時
示蹤抗體工作液的準備,，示蹤抗體1:21的用示蹤抗體稀釋液稀釋,；每條板需1ml的示蹤抗體稀釋液+50ul的胎球蛋白A示蹤抗體
移去蓋板，棄去孔內(nèi)反應液,，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次,，然后*吸出孔內(nèi)液體，或可采用全自動洗板機
以上稀釋的示蹤抗體工作液加100ul至各孔
蓋板,，避免暴露于陽光下
室溫下孵育30min
移去蓋板，棄去孔內(nèi)反應液,，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次,，然后*吸出孔內(nèi)液體，或可采用全自動洗板機
每孔加100ul的ELISAHRP底物液
蓋板,，避免暴露于陽光下
室溫下孵育20min
移去蓋板,，每孔加100ul的終止液，混勻
10min內(nèi)在450nm酶標儀上檢測吸收值
注意：為降低背景色,，可以雙波長檢測,，設置參考波長：595nm或620nm或630nm
操作注意事項
建議所有標準品，質(zhì)控品和未知樣本做雙孔檢測,；各雙孔檢測的吸收均值用于數(shù)據(jù)處理,，結(jié)果計算
將光敏試劑保持裝于原琥珀色瓶內(nèi)
將剩余的包被板條放存在含干燥劑的密封袋內(nèi)，避免受潮
操作嚴格,，移液器經(jīng)校準可確保試驗的可重復性
孵育時間或溫度也可能會影響試驗結(jié)果
避免微孔內(nèi)產(chǎn)生氣泡,，可能會導致結(jié)合率低，雙孔讀數(shù)變異系數(shù)高
使用前所有試劑都應*混勻,，避免產(chǎn)生氣泡
結(jié)果說明
計算各雙孔吸收值均值
所有的吸收均值都減去標準品1（即0ng/ml）的吸收均值
在點對點或?qū)?shù)-對數(shù)坐標紙上以標準品的濃度為X軸,，吸收均值為Y軸繪制標準曲線；或是采用數(shù)據(jù)處理軟件進行結(jié)果計算
質(zhì)控品和樣本濃度（1:10000）可直接從標準曲線上讀取,，若采用的是對數(shù)-對數(shù)或數(shù)據(jù)處理軟件計算則需用到對數(shù)轉(zhuǎn)換,；樣本校正吸收值在濃度1ng/ml和下一個zui高標準品間的需通過公式計算：
未知樣本濃度=未知樣本吸收值x2nd標準品濃度值
預期用途
此試劑盒可用于血清,，血漿,，細胞上清,，組織提取物和尿液中人胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白的定量的檢測,；血清或血漿中胎球蛋白A的檢測可作為某些癌癥及基因遺傳缺陷的血清蛋白診斷的輔助工具,；此試劑盒僅供實驗室專業(yè)人士使用
簡介
胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白,，是由兩個氨基末端抑制域和一個較小的羧基末端域組成的59kDa分子量的糖蛋白,；由肝臟合成，分泌至血流,，成年哺乳動物體內(nèi)的濃度范圍在0.5-1.0g/L,；嬰兒期的血清胎球蛋白A含量高，參與蛋白酶抑制活性,，與鈣代謝和骨調(diào)節(jié)相關(guān),；累積于骨和牙齒內(nèi)，作為生物學上非膠原骨蛋白的主要部分,，研究表明,，胎球蛋白A是循環(huán)中主要的鈣化抑制劑；干涉鈣鹽沉淀,；近期研究顯示低水平胎球蛋白A的慢性腎臟衰竭患者與心血管病的高死亡率顯著相關(guān),；另一方面,，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，這是獨立于胰島素抑制劑的其他標記物,；另外,，高胎球蛋白A水平還可作為心血管疾病的的危險標記物
實驗原理
此試劑盒可用于血清樣本中人胎球蛋白A的定量檢測；采用雙位點夾心法,，羊抗人胎球蛋白A多抗結(jié)合人胎球蛋白A的不同位點
將含人胎球蛋白A的試驗標準品,，質(zhì)控品和預稀釋樣本加至包被了高度親和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔內(nèi)，*次孵育,，包被抗體捕獲樣本中的人胎球蛋白A,，未結(jié)合的蛋白洗板除去，然后加入HRP標記的抗人胎球蛋白A酶聯(lián)物加入至每孔,，“夾心-人胎球蛋白A-HRP-標記的酶聯(lián)物”形成夾心,，未結(jié)合的示蹤抗體通過洗板除去，結(jié)合于包被板上的HRP酶免物與底物液定時反應,，然后在酶標儀上檢測,；結(jié)合于包被胎球蛋白A上示蹤抗體酶活性與樣本中胎球蛋白A的含量直接相關(guān)，在點對點或三次回歸模式下以標準品的濃度比上OD值繪制標準曲線,，樣本中的胎球蛋白A可直接從標準曲線上得到
試劑：準備與貯存
此試劑盒收到后立即貯存于2-8℃下,，效期見試劑盒標簽；所有成分在2-8℃下可保存至有效期
使用前,，所有試劑平衡至室溫,，不同批次的試劑不能交換使用
包被板，96孔,，包被了抗人胎球蛋白A抗體,；微孔板固定于板架上，密封于含有干燥劑的鋁箔密封袋內(nèi),；貯存于2-8℃至有效期
胎球蛋白A示蹤抗體,，1瓶，0.6ml,，濃縮,，HRP標記的抗人胎球蛋白A示蹤抗體溶于穩(wěn)定的蛋白基質(zhì)中；此試劑使用前需用示蹤劑抗體稀釋液進行稀釋,；貯存于2-8℃至有效期
示蹤抗體稀釋液,，1瓶，11ml,，即用,，Trizma鹽酸溶于緩沖液；根據(jù)實驗步驟用于示蹤抗體稀釋,；貯存于2-8℃至有效期
試驗緩沖液,，濃縮,，1瓶，11ml,，含牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽,；建議使用前以1:10比例用雙蒸水稀釋（如11ml濃縮+99ml的雙蒸水）；貯存于2-8℃至有效期
洗滌液,，濃縮，1瓶,，20ml,，30倍濃縮；試驗前需用580ml的雙蒸水稀釋,，混勻,；一旦稀釋，不含疊氮化物防腐劑的磷酸緩沖鹽洗滌液會含表面活性劑,；稀釋的洗滌液在室溫下可保存至效期
HRP底物液,；1瓶，12ml,，含過氧化氫的TMB底物液,；貯存于2-8℃至有效期
終止液，1瓶,，12ml,，0.5M硫酸，貯存于2-8℃至有效期
胎球蛋白A標準品,，5瓶,，含胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態(tài)牛血清基質(zhì),；各標準品濃度見瓶子標簽,；3次凍存周期使用后，所有標準品保存至-20℃或更低
胎球蛋白A質(zhì)控,，2瓶,，含人胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態(tài)牛血清基質(zhì),，各質(zhì)控的濃度范圍見瓶子標簽,，3次凍存周期使用后質(zhì)控保存至-20℃或更低
安全注意事項
此試劑用于臨床參考實驗室，僅供醫(yī)生或?qū)嶒炇覍I(yè)人士體外診斷用
若試劑是有潛在感染風險的,，試驗操作和處理時應戴手套
避免接觸含TMB,，過氧化氫，硫酸的試劑,，TM,B會刺激皮膚和粘膜,，導致皮膚過敏反應,；TMB還可能是致癌物質(zhì)；皮膚接觸到硫酸會導致嚴重灼傷,，不要接觸到眼睛,，皮膚，衣服,，不要吸入煙霧,，一旦接觸，應立即用大量水沖洗至少15min
良好實驗室操作規(guī)范
實驗所需材料但試劑盒未提供
的單通道移液器,，10-25-100-1000ul
適于100ul的可重復用分液器
適于所有體積的一次性槍頭
一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm
帶蓋的一次性塑料瓶,；100-1000ml
鋁箔紙
雙蒸水或去離子水
塑料蓋板或聚乙烯薄膜
多通道洗滌瓶或全自動（半自動）洗板系統(tǒng)
酶標儀，450nm
樣本采集
人胎球蛋白A的檢測所需血清或血漿樣本量僅10ul
個人在采樣前無需特殊準備,，全血采集,，室溫下立即凝集30min，然后離心分離出血清（850-1500xg10min）,。全血采集3小時內(nèi)需將血清從凝集中分離出來,，轉(zhuǎn)移至另一干凈試管；血清樣本可保存在-20℃或更低,，避免超過三次的凍融
建議采用24小時尿液來檢測尿液中的胎球蛋白A,；采集第二天早晨的尿液，排除采樣前剛進行劇烈運動的,，因腎功能不全導致多尿的,；由利尿藥引起的人體內(nèi)尿蛋白含量波動降低，可能與尿肌酸酐濃度相關(guān),；
細胞上清,，組織提取物則需進行試驗樣本的倍比稀釋；多個平行樣檢測得到更的試驗結(jié)果
實驗步驟
患者樣本的準備
患者血清或血漿樣本在檢測前需用試驗緩沖液進行1:10000的稀釋
以1A和1B標記兩個試管（12x75mm）
加1ml的試驗緩沖液至各試管（1A和1B）
加10ul的患者血清至1A試管,，混合（1:100）
從1A管內(nèi)吸取10ul已稀釋的樣本至1B試管,，混合（1:10000）
注意：建議采用/經(jīng)校準的移液器，稀釋過程小心操作,，得到更的結(jié)果,；建議采用多通道（Combitip）12.5ml的Eppendorf可重復移液器加1ml的試驗緩沖液，而不用50ml的槍頭
患者尿液樣本的實驗前用試驗緩沖液1:100的稀釋
以1標記一試管（12x75mm）
各管加1ml試驗緩沖液
加10ul患者尿液樣本至1管,，混合（1:100）
注意：若所得結(jié)果中樣本濃度高于5個標準品中的zui高標準品濃度,，則尿液樣本需進一步稀釋（如1:500），然后重新檢測
試劑準備
試驗前將所有試劑平衡至室溫,，不同批次的試劑不能混合使用
使用前,，試驗緩沖液（濃縮）及洗滌液（濃縮）需進行稀釋，配制成工作液；詳情請見“試劑”部分
試驗操作
將實驗所需板條固定于板架上,，標準品,，質(zhì)控品及未知樣本做雙孔檢測
試驗布局
ROWSTRIP1STRIP2STRIP3
ASTD1STD5SAMPLE2
BSTD1STD5SAMPLE2
CSTD2C1SAMPLE3
DSTD2C1SAMPLE3
ESTD3C2
FSTD3C2
GSTD4SAMPLE1
HSTD4SAMPLE1
加25ul的標準品，質(zhì)控品及預稀釋的1:10000樣本至相應孔內(nèi),；注意：尿液樣本是1:100的稀釋
每孔加100ul的試驗緩沖液
混勻,，蓋板，避免暴露于陽光下
室溫下孵育2小時
示蹤抗體工作液的準備,，示蹤抗體1:21的用示蹤抗體稀釋液稀釋,；每條板需1ml的示蹤抗體稀釋液+50ul的胎球蛋白A示蹤抗體
移去蓋板，棄去孔內(nèi)反應液,，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次,，然后*吸出孔內(nèi)液體，或可采用全自動洗板機
以上稀釋的示蹤抗體工作液加100ul至各孔
蓋板,，避免暴露于陽光下
室溫下孵育30min
移去蓋板，棄去孔內(nèi)反應液,，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次,，然后*吸出孔內(nèi)液體，或可采用全自動洗板機
每孔加100ul的ELISAHRP底物液
蓋板,，避免暴露于陽光下
室溫下孵育20min
移去蓋板,，每孔加100ul的終止液，混勻
10min內(nèi)在450nm酶標儀上檢測吸收值
注意：為降低背景色,，可以雙波長檢測,，設置參考波長：595nm或620nm或630nm
操作注意事項
建議所有標準品，質(zhì)控品和未知樣本做雙孔檢測,；各雙孔檢測的吸收均值用于數(shù)據(jù)處理,，結(jié)果計算
將光敏試劑保持裝于原琥珀色瓶內(nèi)
將剩余的包被板條放存在含干燥劑的密封袋內(nèi)，避免受潮
操作嚴格,，移液器經(jīng)校準可確保試驗的可重復性
孵育時間或溫度也可能會影響試驗結(jié)果
避免微孔內(nèi)產(chǎn)生氣泡,，可能會導致結(jié)合率低，雙孔讀數(shù)變異系數(shù)高
使用前所有試劑都應*混勻,，避免產(chǎn)生氣泡
結(jié)果說明
計算各雙孔吸收值均值
所有的吸收均值都減去標準品1（即0ng/ml）的吸收均值
在點對點或?qū)?shù)-對數(shù)坐標紙上以標準品的濃度為X軸,，吸收均值為Y軸繪制標準曲線；或是采用數(shù)據(jù)處理軟件進行結(jié)果計算
質(zhì)控品和樣本濃度（1:10000）可直接從標準曲線上讀取,，若采用的是對數(shù)-對數(shù)或數(shù)據(jù)處理軟件計算則需用到對數(shù)轉(zhuǎn)換,；樣本校正吸收值在濃度1ng/ml和下一個zui高標準品間的需通過公式計算：
未知樣本濃度=未知樣本吸收值x2nd標準品濃度值