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大分子蛋白結合物的制備
閱讀：513 發(fā)布時間：2013-4-22
酶免疫測定的酶—大分子蛋白結合物的制備
酶結合物可以說是酶免疫測定試劑盒的核心組成部分,。通常酶免疫測定試劑盒的有效使用期限即是根據(jù)酶結合物的穩(wěn)定性而定的,。因為在酶免疫測定試劑盒中，zui易受外環(huán)境影響的組成試劑即是酶結合物,。此外,，酶結合物的質量亦是影響試劑盒質量的很重要的因素之一，可見酶結合物的制備對于酶免疫測定來說,，是非常關鍵的一個環(huán)節(jié),。
酶—抗體（或其他大分子蛋白）結合物是酶免疫測定的有機組成部分，也是其測定基礎之所在,。通常,，酶結合物（酶標抗體或抗原）一般均是通過化學交聯(lián)而得到的。一個理想的化學交聯(lián)方法應能得到分子組成明確,、酶及抗體或抗原不失活,、連接鍵穩(wěn)定且經(jīng)濟的*耦合的結合物。
酶—蛋白的耦合方法可分為三大類,，即①酶與蛋白的隨機共價交聯(lián)方法,；如戊二醛方法；②通過特定化學基團進行共價交聯(lián)的方法,，如過碘酸鈉方法及采用各種均一和非均一雙功能交聯(lián)劑的方法,；③通過非共價鍵交聯(lián)的方法，如酶—抗酶免疫復合物方法,。這些方法各有其優(yōu)缺點,，如戊二醛方法，由于交聯(lián)的隨機性,，所得到的酶結合物大小不一,，其中許多分子量很大，超過1 000kD,，這樣的酶結合物的酶活性與游離酶相比,，將大大降低。此外,，大分子的酶結合物在免疫測定還有可能對測定形成空間位阻,。使用過碘酸鈉方法制備酶結合物，操作簡單,，所得到的酶結合物大小合適,，酶的活性可以保留80％以上。酶—抗酶免疫復合物這種非共價鍵交聯(lián)方法并非嚴格意義上的酶—蛋白耦聯(lián)方法,，本處不做介紹,。
下面介紹幾個具體的酶與蛋白大分子的交聯(lián)方法,。
1、過碘酸鈉方法
Nakame和Kawaoi于1974年設計了這種可用于糖蛋白且極為有效的化學耦聯(lián)方法,，以后又有人對這種方法進行了改良,，這種改良方法是目前用于HRP標記抗體或抗原的zui常用的方法。與GA方法比較,，這種方法的得到的耦聯(lián)物的產(chǎn)率至少要高3～4倍,。方法的原理如下：過氧化物酶的所有氨基首先用1—氟—2，4—二硝基苯（Sanger試劑）（DNFB）不可逆地封閉,，然后用Nal04的糖鏈（占總重量的21％）,，產(chǎn)生醛基和羧基，醛基與所加入的蛋白（1gG或SPA）的游離氨基形成Schiff堿（但不與本身已封閉的氨基作用）,，這種不穩(wěn)定的氨基—羰基化合物可用硼氫化鈉（NaBH：）還原形成穩(wěn)定的耦聯(lián)產(chǎn)物（圖6—1）,。這種方法大約會使70％的過氧化物酶和約99％的IgG耦聯(lián)。每個IgG分子zui多可耦聯(lián)5—6個過氧化物酶分子,。如要得到每個IgG分子結合酶分子的一定比，可在理論上計算出應加入到抗體中的活化的過氧化物酶的量,。
2,、使用化學交聯(lián)試劑耦聯(lián)酶與抗體或其他蛋白
用于酶與抗體或其他蛋白耦聯(lián)的所有化學交聯(lián)試劑至少要有兩個反應基團，根據(jù)其兩個反應基團是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑,。均一的雙功能交聯(lián)劑,，其兩個反應基團相同；而在非均一的雙功能交聯(lián)劑中,，兩個反應基團不同,，每個基團可能于不同的條件下反應。理論上,，非均一交聯(lián)劑的基團的結合反應易于控制,。一般來說，均一的雙功能試劑只能用于一步法,，即將酶和其他蛋白（例如抗體,、抗原、SPA或親合素）與交聯(lián)劑一起混合后反應,。一步法難于控制結合物的大小和組成,。如果第二個基團的活化要求不同的條件或待交聯(lián)蛋白之一與該交聯(lián)劑反應不強時，某些均一的雙功能交聯(lián)劑亦可用于兩步方法,。