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                                               冰凍切片的免疫組化染色操作步驟

1. 新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機內(nèi)切片（ 也可- 80℃保存），厚度為 5～6μm,。

2. 載玻片可不打底,，裱片后，立即用電吹風吹干,。

3. 如不馬上染色,，可密封后- 20℃保存。

4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分鐘,。

5. PBS 洗 2 次,，每次 5 分鐘，（ 必要時應用 0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔）

6. 3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶,，20 分鐘,，避光;

7. 用 PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘;

8. 正常血清封閉：從染片缸中取出切片,，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 （保持組織呈濕潤狀態(tài),）滴加正常山羊或兔血清 （與第二抗 體 同源動物血清）處理,，37℃，15 分鐘,。

附：正常血清配制 （ 或按試劑盒規(guī)定的濃度配制）：按 1:20比例,，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl （10%拋灑量） 計算。

9.滴加*抗體：用濾紙吸去血清,，不洗,，直接滴加*抗體，37℃ 2 小時（也可置于 4℃冰箱過夜） ,。

10.PBS：5 分鐘,，2 次（置于搖床） 。

11.滴加生物素化的二抗,，37℃,，40 分鐘。

12.PBS：5 分鐘,，2 次（置于搖床） ,。

13.滴加三抗 （SAB 復合物） ，37℃,，40 分鐘,。

14.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） ,。

15.DAB 顯色,，鏡下觀察，適時終止（自來水沖終止） ,。

附：DAB 的配制① 儲備液（DAB 25mg/ml）的配制：DAB 250mg + PBS 10ml,，待*溶解后分裝成 1ml，100μl,，50μl ,，20μl 等，-20℃,，凍存。② 工作液：DAB 儲備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

16.自來水（細水）充分沖洗,。

17.蘇木素復染,，室溫，30 秒,，自來水沖洗,。

18.自來水沖洗返藍，15 分鐘,。

19.梯度酒精脫水：80%,，2 分鐘 95%，2 分鐘 100%,，2 次,，5 分鐘。

20.二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分鐘

21.封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片,。