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雞腫瘤壞死因子α試劑盒說明書（TNF-a）說明書下載
閱讀：313 發(fā)布時間：2012-10-18 試劑僅供研究使用
試驗原理：
TNF-A試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知TNF-A濃度的標準品,、未知濃度的樣品 加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將TNF-A和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,，加入親和素標記過的HRP,。再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,，然后加入底物A、B,，和酶結(jié)合物同時作用,。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-A的濃度呈比例關(guān)系,。
試劑盒內(nèi)容及其配制：
| 試劑盒成份 | 96孔配置 | 48孔配置 |
| 96/48人份酶標板 | 1塊板（96T） | 半塊板（48T） |
| 塑料膜板蓋 | 1塊 | 半塊 |
| 標準品:400pg/ml | 1瓶（1.0ml） | 1瓶（0.5ml） |
| 空白對照 | 1瓶（1.0ml） | 1瓶（0.5ml） |
| 標準品稀釋緩沖液 | 1瓶（8.0ml） | 1瓶（4.0ml） |
| 生物素標記的抗TNF-A抗體 | 1瓶（8.0ml） | 1瓶（4.0ml） |
| 親和鏈酶素-HRP | 1瓶（12ml） | 1瓶（5ml） |
| 洗滌緩沖液 | 1瓶（20ml） | 1瓶（10ml） |
| 底物A | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） |
| 底物B | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） |
| 終止液 | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） |
1. 蒸餾水,。
2. 加樣器：5ul、10ul,、50ul,、100ul、200ul,、500ul,、1000ul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等,。
樣品收集,、處理及保存方法：
1、 血清……操作過程中避免任何細胞刺激,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清
2,、和紅細胞迅速小心地分離,。
2、 血漿……EDTA,、檸檬酸鹽,、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。
3,、 細胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4,、 組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,，取上清液,。
5、 保存……如果樣品不立即使用,，應將其分成小部分-70℃保存,，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,，檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
雞腫瘤壞死因子α試劑盒操作注意事項：
● 試劑應按標簽說明書儲存,，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,，不可保存,。
● 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存,，以免變質(zhì),。
● 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用,。
● 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A,、B液時,，避免使用帶金屬部分的加樣器。
● 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。
● 底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,，有毒,。實驗完成后應立即讀取OD值。
● 加入試劑的順序應一致,，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣,。
● 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作,。
安全性：
2. 實難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品,。
3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。
試劑的準備：
| 400 pg/ml | （6號標準品） | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul |
| 200 pg/ml | （5號標準品） | 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
| 100 pg/ml | （4號標準品） | 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
| 50 pg/ml | （3號標準品） | 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
| 25 pg/ml | （2號標準品） | 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
| 12.5 pg/ml | （1號標準品） | 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
| 0 pg/ml | （空白對照） | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul |
試劑盒性能：
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990,。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%,。
ELISA試劑盒操作步驟：
1. 使用前，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差,。
2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復孔的盡量做復孔,。
3. 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi),。立即加入50ul的生物素標記的抗體,。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育45分鐘,。
4. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復此操作4次,。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。
5. 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘,。
6. 甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復此操作4次,。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次。
7. 每孔加入底物A,、B各50ul,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘,。避免光照,。
8. 取出酶標板，迅速加入50ul終止液,，加入終止液后應立即測定結(jié)果,。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié) 果 判 斷 與 分 析：
1,、 儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2,、 以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的TNF-A標準品濃度為橫坐標（X）,，做得相應的曲線,，樣品的TNF-A含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。
3,、 檢測值范圍： 0-400pg/ml
4,、 敏感度：1.0pg/ml