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人抗著絲點抗體（ACA/CENP）ELISA檢測試劑盒說明書
閱讀：258 發(fā)布時間：2012-9-4| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 人抗著絲點抗體（ACA/CENP）ELISA檢測試劑盒 本試劑僅供研究使用 試驗原理： ACA/CENP試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知ACA/CENP濃度的標(biāo)準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進行檢測,。先將ACA/CENP和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育,。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP,。再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A,、B,，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色,。顏色的深淺和樣品中ACA/CENP的活性濃度呈比例關(guān)系,。 試劑盒內(nèi)容及其配制
自備材料 1． 蒸餾水。 2． 加樣器：5ul,、10ul,、50ul、100ul,、200,、500ul、1000ul,。 3． 振蕩器及磁力攪拌器等,。 安全性 1． 避免直接接觸終止液和底物A、B,。一旦接觸到這些液體,，請盡快用水沖洗。 2． 實驗中不要吃喝,、抽煙或使用化妝品,。 3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。 操作注意事項 1． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,，使用前恢復(fù)到室溫,。稀稀過后的標(biāo)準品應(yīng)丟棄，不可保存,。 2． 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,，密封保存，以免變質(zhì),。 3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用,。 4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染,，吸取終止液和底物A、B液時,，避免使用帶金屬部分的加樣器,。 5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。 6． 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。 7． 底物A應(yīng)揮發(fā),，避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下,。避免用手接觸,，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值,。 8． 加入試劑的順序應(yīng)一致,，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。 9． 按照說明書中標(biāo)明的時間,、加液的量及順序進行溫育操作,。 樣品收集、處理及保存方法 1,、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離,。 2、 血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽,、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。 3,、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。 4,、 保存------如果樣品不立即使用,，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒,，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。 試劑的準備 1． 標(biāo)準品：標(biāo)準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備，不能儲存,。稀釋前將標(biāo)準品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進行：
2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋,。 操作步驟 1． 使用前，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差,。 2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個標(biāo)準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。 3． 加入稀釋好后的標(biāo)準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體,。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育1小時,。 4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。 5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘,。 6． 甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次,。 7． 每孔加入底物A、B各50ul,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育10分鐘,。避免光照,。 8． 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液,，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果,。 9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。 性能 1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準品,。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。 2. 特異性：不與人其它細胞因子反應(yīng),。 3. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%。 4.局限性：6號標(biāo)準品以上的結(jié)果為非線性的,，根據(jù)此標(biāo)準曲線無法得到的結(jié)果,。 結(jié)果 判 斷與分析 1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值 2,、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y）,，相應(yīng)的ACA/CENP標(biāo)準品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線,，樣品的ACA/CENP含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準曲線換算出相應(yīng)的濃度,。 3、檢測值范圍：0-400ng/ml 4,、敏感度： 1.0ng/ml | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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