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業(yè)務(wù):   何

ELISA實驗原理、步驟,、ELISA問題分析

ELISA實驗原理

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay,，ELISA）原理

1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量測定的文章,，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法,。

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,，又保留酶的活性。在測定時,，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上,。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析,。

由于酶的催化頻率很高,，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度

類型及步驟

ELISA的主要常用類型及步驟

1. 間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法,。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（二抗）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,，故稱為間接法。操作步驟如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗原,，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

2）加稀釋的樣本,，保溫反應(yīng),。樣本中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體，樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去,。

3）加酶標(biāo)抗抗體,。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶,。洗滌后,，固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關(guān)。

4）加底物顯色,。

2. 雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,，操作步驟如下：

1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體,。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),。

2）加受檢樣本，保溫反應(yīng),。樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合,，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì),。

3）加酶標(biāo)抗體,，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,。此時固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關(guān)。

4）加底物顯色,。

3. 雙抗原夾心法測抗體

反應(yīng)原理和模式與雙抗體夾心法類似,。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體,。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體

4.競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式,。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合,。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,，zui后的顯色也愈淺,。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法,。

ELISA Q&A

如何選擇合適的陽性對照?

陽性對照的基本組成應(yīng)該盡量與檢測樣本的組成一致,，一般陽性對照多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)，加入一定量的待檢物質(zhì),。比如,，以人血清為標(biāo)本的測定，陽性對照多用確定的病人血清或者以復(fù)鈣人血漿為原料加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品,。

如何選擇合適的陰性對照?

陰性對照的基本組成也應(yīng)該盡量與檢測樣本的組成一致,，先行檢測確定其中不含待檢物質(zhì)。比如，檢測人血清標(biāo)本時,，陰性對照應(yīng)該選擇正常人血清;檢測免疫動物血清中抗體效價時,，陰性對照應(yīng)該選擇該動物的免疫前血清。

如何選擇*化的包被條件?

1.包被抗原的選擇

包被抗原可分為天然蛋白,、重組蛋白和小分子抗原三大類,。天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上,，再通過特異性反應(yīng)使抗原固相化）,。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機化合物,，由于分子量太小,，往往難于直接吸附在酶標(biāo)板上，一般都先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián),，偶聯(lián)物吸附于固相載體上,。

2.包被液的選擇

一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液，如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話,，也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液,。

3.包被溫度的選擇

通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時，我們強烈建議4-8度條件下包被,，有利于蛋白活性的保持,。

4.包被濃度的選擇

包被的zui適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化，一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml,，要明確針對特定包被抗原的zui適包被濃度需要通過實驗來確定,。

包板后需要封閉嗎?應(yīng)該選擇什么樣的封閉體系?

封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件,。一般說來,，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的,，操作時洗滌*,，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。而在間接法測定中,，封閉一般是*的,。

常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清,、1%明膠,、5%的脫脂奶粉，AbMART推薦使用5%脫脂奶粉,，價廉而且封閉能力強,，不過5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用,，不宜長期保存，所以試劑盒中較少使用,。

如何正確使用酶結(jié)合物?

1.酶結(jié)合物的稀釋液

在稀釋液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%BSA或5%脫脂奶粉）,，通過競爭抑制酶結(jié)合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑,，如吐溫20（0.05%的濃度較為適宜）,。

2.正確稀釋酶結(jié)合物

酶結(jié)合物的合適工作濃度需要通過預(yù)實驗來確定,，濃度過高易導(dǎo)致本底偏高,，濃度過低則會導(dǎo)致陽性信號的減弱。

酶結(jié)合物在使用前稀釋,，稀釋后的酶結(jié)合物不宜長期保存,，因為低濃度的酶結(jié)合物極易失活。