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大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）ELISA試劑盒

本試劑盒僅供研究使用,。

檢測范圍：                                                          96T

0pg/ml-160pg/ml

使用目的：

本試劑盒用于測定大鼠血清,、血漿及相關液體樣本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）含量,。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）水平,。用純化的大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），再與HRP標記的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗體結合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）濃度。 

試劑盒組成 

標本要求 

1．標本采集后盡早進行提取,，提取按相關文獻進行,，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

3. 血清：

室溫血液自然凝固10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。

4. 血漿：

應根據(jù)標本的要求選擇EDTA,、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心,。

5. 尿液：

用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。胸腹水,、腦脊液參照此實行,。

6. 細胞培養(yǎng)上清：

檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清,。

7. 培養(yǎng)細胞

     檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心,。

8. 組織標本

切割標本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?/font>2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用,。

自備材料

1．  蒸餾水。

2．  加樣器：5ul,、10ul,、50ul、100ul,、200,、500ul、1000ul,。

3．  振蕩器及磁力攪拌器等

操作步驟

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

2. 

3. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）,、標準孔、待測樣品孔,。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。

4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。   

5. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

6. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復5次,，拍干,。

7. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外,。 

8. 溫育：操作同3,。

9. 洗滌：操作同5,。

10. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

11. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

12. 測定：以空白空調零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

操作程序總結：

計算

  以標準物的濃度為橫坐標,，OD值為縱坐標,，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。 

注意事項

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存,。

2．濃洗滌液可能會有結晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結果。

3．各步加樣均應使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內,，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定,，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。

6．底物請避光保存,。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理,。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異,，以英文說明書為準,。

性能

1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990,。

2. 特異性：不與大鼠其它細胞因子反應。

3. 重復性：板內,、板間變異系數(shù)均小于10%,。

4. 局限性：6號標準品以上的結果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到的結果,。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：,；2-8℃。

2．有效期：6個月