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免疫熒光技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題及分析
閱讀：1983 發(fā)布時(shí)間：2012-7-24| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 24.5KB |
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免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種。主要是利用熒光標(biāo)記的抗體與待測(cè)抗原間反應(yīng)進(jìn)行抗原或者半抗原物質(zhì)定位的技術(shù),。本文總結(jié)了免疫熒光技術(shù)常見(jiàn)的問(wèn)題及解析,。
1、問(wèn)：近期要做免疫熒光雙標(biāo),，不知哪位有免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)的詳細(xì)步驟及其注意事項(xiàng)?
參考見(jiàn)解：我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染,。我的經(jīng)驗(yàn)是：
（1）選取一抗時(shí)要來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來(lái)源于rabbit和rat的抗體,，二抗則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的,，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。
（2）我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育,，然后兩種二抗同時(shí)孵育,。抗體濃度,、孵育時(shí)間要仔細(xì)摸索,，我感覺(jué)一抗4度孵育過(guò)夜比較好，背景比較清晰,。
（3）我的陽(yáng)性對(duì)照用的是陽(yáng)性組織切片,，陰性對(duì)照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物,。
（4）封閉血清與二抗來(lái)源動(dòng)物一致,，我用的是10%的正常donkey血清。
（5）其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作,。
2,、問(wèn)：用免疫熒光方法做組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白，兩者操作過(guò)程有哪些不同?
參考見(jiàn)解：只是固定方法不同,。細(xì)胞固定用甲醇,，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的,。
3,、問(wèn)：本人擬做Brdu標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光，二抗為FITC標(biāo)記,，想請(qǐng)教各位大俠：
（1）抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時(shí)是否一定要在暗室中進(jìn)行?
（2）封片時(shí)是否用甘油緩沖液即可,，還是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液等量混合封片?
（3）免疫酶染色中的3%過(guò)氧化氫及2N鹽酸是否還需要用?
參考見(jiàn)解：
（1）你的二抗是用FITC標(biāo)記的，為避免熒光分解,，分裝及熒光顯微鏡觀察時(shí)均要避光;
（2）封片用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液,，后者能使玻片透明;
（3）關(guān)于免疫酶染色，如果是用過(guò)氧化物酶做標(biāo)記,，就必須用3%H2O2以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;2N鹽酸需要使用,，目的是使DNA變性,，讓Brdu抗體能夠充分地與已經(jīng)摻入的Brdu結(jié)合。
4,、問(wèn)：做間接法免疫熒光染色,，如何設(shè)置對(duì)照?
參考見(jiàn)解：是同一視野在未用熒光激發(fā)下進(jìn)行對(duì)照，看是否非特異性染色,。
（1）空白對(duì)照：如果你做的是石蠟切片免疫組化,，這個(gè)對(duì)照必須有，目的是看自發(fā)熒光,，脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察,。
（2）陰性對(duì)照：標(biāo)本直接滴加二抗，呈陰性反應(yīng),。
（3）抗原對(duì)照：標(biāo)本加同種動(dòng)物的未免疫血清,，以PBS沖洗后,，在加抗免疫球蛋白熒光抗體,。因未免疫動(dòng)物的血清中無(wú)特異性抗體，應(yīng)呈陰性反應(yīng),。
5,、問(wèn)：我做乳腺組織的免疫熒光染色，結(jié)果用激光共聚焦顯微鏡看很好：有陽(yáng)性信號(hào),，陰性對(duì)照組也沒(méi)有熒光,，但是拿到熒光顯微鏡下看，我的陰性對(duì)照組一片綠,，像非特異性染色,，到底哪個(gè)結(jié)果才是真實(shí)的呢?
參考見(jiàn)解：激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，出現(xiàn)上述現(xiàn)象首先要排除熒光顯微鏡的問(wèn)題,，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因,，熒光顯微鏡沒(méi)有問(wèn)題，那就以共聚焦顯微鏡的結(jié)果為主,。
免疫標(biāo)記法可分為以下幾類：熒光免疫法,、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）,、偶聯(lián)生物素—親和素系統(tǒng)的酶免法,、時(shí)間分辨熒光免疫分析、解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?。免疫熒光?shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞涂片的制備,、細(xì)胞的固定及通透（或稱為透化）、細(xì)胞封閉,、一抗和二抗抗體孵育及熒光檢測(cè)等,。