試劑盒使用說(shuō)明書
本試劑盒僅供研究使用,。
檢測(cè)范圍： 96T
50ng/L -1250ng/L
使用目的：
本試劑盒用于測(cè)定兔血清,、血漿及相關(guān)液體樣本中血小板活化因子（ PAF）含量,。實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中兔血小板活化因子（ PAF）水平。用純化的兔血小板活化因子（ PAF）抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入血小板活化因子（ PAF）,，再與 HRP標(biāo)記的血小板活化因子（ PAF）抗體結(jié)合,，形成抗體 -抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB顯色,。 TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血小板活化因子（ PAF）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在 450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ OD值）,，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中兔血小板活化因子（ PAF）濃度,。試劑盒組成
| 1 | 30倍濃縮洗滌液 | 20ml×1瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1瓶 | | 2 | 酶標(biāo)試劑 | 6ml×1瓶 | 8 | 標(biāo)準(zhǔn)品（ 2400ng/L） | 0.5ml×1瓶 | | 3 | 酶標(biāo)包被板 | 12孔 × 8條 | 9 | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 1.5ml×1瓶 | | 4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1瓶 | 10 | 說(shuō)明書 | 1份 | | 5 | 顯色劑 A液 | 6ml×1瓶 | 11 | 封板膜 | 2張 | | 6 | 顯色劑 B液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1個(gè) | |
標(biāo)本要求
1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于 -20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因 NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（ HRP）活性。操作步驟
1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋,。
2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、
待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50µl,，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl,，然后再加待測(cè)樣品 10µl（樣品zui終稀釋度為 5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 3 0分鐘,。
4.配液： 30倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30倍稀釋后備用
5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置 30秒后棄去，如此重復(fù) 5次,，拍干,。
6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50µl，空白孔除外,。
7.溫育：操作同 3,。
8.洗滌：操作同 5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl,，再加入顯色劑 B50µl,，輕輕震蕩混勻， 37℃避光顯色15分鐘.
10.終止：每孔加終止液 50µl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11.測(cè)定：以空白空調(diào)零， 450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（ OD值）,。測(cè)定應(yīng)在加終止
| 1200ng/L | 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150µl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | | 600ng/L | 4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150µl的 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | | 300ng/L | 3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150µl的 4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | | 150ng/L | 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150µl的 3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | | 75ng/L | 1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 | 150µl的 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | |
液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。操作程序總結(jié)：
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),， OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的 OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的 OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。注意事項(xiàng)
1 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
2 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。
3 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間控制在 5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
4 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本 OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n倍）后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。
6 底物請(qǐng)避光保存,。
7 嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) .
8 所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。保存條件及有效期
10 2-8℃,。
11 6個(gè)月
標(biāo)本收集方法：
1. 血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。
2. 血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
3. 尿液：
用無(wú)菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行,。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。
5. 培養(yǎng)細(xì)胞
檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右,。通過(guò)反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。
6. 組織標(biāo)本
切割標(biāo)本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè),，其余冷凍備用,。
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