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ELISA的概念,、原理,、操作步驟
閱讀：545 發(fā)布時間：2011-8-23
ELISA的概念、原理,、操作步驟
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（ Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）的簡稱,。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問世以來,，發(fā)展十分迅速,，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領(lǐng)域,。
（一） 原理
ELISA是以免疫學反應(yīng)為基礎(chǔ),，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù),。由于抗原,、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后,，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中,，通過不同的設(shè)計,，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法（圖a）,、用于檢測抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等,。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
ELISA是以免疫學反應(yīng)為基礎(chǔ),，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù),。由于抗原,、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后,，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中,，通過不同的設(shè)計,，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法（圖a）,、用于檢測抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等,。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
（二） 操作步驟
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml,。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,，4℃過夜。次日,，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘,。（簡稱洗滌,，下同）。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時,。然后洗滌,。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）,。
3. 加酶標抗體：于各反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時,，洗滌,。
4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘,。
5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml,。
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強,，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”,、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上,，于450nm（若以ABTS顯色,，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,，即為陽性。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
1,、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml,，每孔加0.1ml，4℃過夜,。
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml,。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,，4℃過夜。次日,，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘,。（簡稱洗滌,，下同）。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時,。然后洗滌,。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）,。
3. 加酶標抗體：于各反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時,，洗滌,。
4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘,。
5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml,。
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強,，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”,、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上,，于450nm（若以ABTS顯色,，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,，即為陽性。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
1,、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml,，每孔加0.1ml，4℃過夜,。
2,、次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌,。同時做空白,、陰性及陽性孔對照于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml,，37℃孵育30-60分鐘,，洗滌,zui后一遍用DDW（超純水）洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4,、5,、6,。
3. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘,。
4. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml,。
5. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強,，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”,、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上,，于450nm（若以ABTS顯色,，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,，即為陽性。
4. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml,。
5. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強,，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”,、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上,，于450nm（若以ABTS顯色,，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,，即為陽性。
（三） 試劑器材
1. 試劑
（1） 包被緩沖液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）:
NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸餾水至1000ml
（2） 洗滌緩沖液（PH7.4 PBS）：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
（3） 稀釋液:牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清,、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用,。
（4） 終止液（2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml,。
（5） 底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:0.2M Na2HPO4（28.4克／L） 25.7ml 0.1M檸檬酸（19.2克／L） 24.3ml 加蒸餾水50ml,。
（6） TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:TMB（10mg／5ml無水乙醇） 0.5ml底物緩沖液（PH5.5） 10ml0.75％H2O2 32μl
（7） ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液（PH5.5） 1ml 3％H2O2 2μl
（8） 抗原、抗體和酶標記抗體,。
（9） 正常人血清和陽性對照血清。
2. 器材:
（1） 聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔,，ELISA檢測儀,，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭,，小毛巾,，洗滌瓶。
（2） 小燒杯,、玻璃棒,、試管、吸管和量筒等,。
（3） 4℃冰箱,，37℃孵育箱。
1. 試劑
（1） 包被緩沖液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）:
NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸餾水至1000ml
（2） 洗滌緩沖液（PH7.4 PBS）：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
（3） 稀釋液:牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清,、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用,。
（4） 終止液（2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml,。
（5） 底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:0.2M Na2HPO4（28.4克／L） 25.7ml 0.1M檸檬酸（19.2克／L） 24.3ml 加蒸餾水50ml,。
（6） TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:TMB（10mg／5ml無水乙醇） 0.5ml底物緩沖液（PH5.5） 10ml0.75％H2O2 32μl
（7） ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液（PH5.5） 1ml 3％H2O2 2μl
（8） 抗原、抗體和酶標記抗體,。
（9） 正常人血清和陽性對照血清。
2. 器材:
（1） 聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔,，ELISA檢測儀,，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭,，小毛巾,，洗滌瓶。
（2） 小燒杯,、玻璃棒,、試管、吸管和量筒等,。
（3） 4℃冰箱,，37℃孵育箱。
（四） 注意事項
1. 正式試驗時,，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高,，說明有非特異性反應(yīng),，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉,。
2. 在ELISA中,，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
（1） 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體,，如聚氯乙烯,、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等,。其形式可以是凹孔平板,、試管、珠粒等,。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板,。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被,，在同一實驗條件下進行反應(yīng),，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好,。
?。?/span>2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間,。吸附溫度,，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1,、1.0和10μg／ml等）進行包被后,，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值,。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度,。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。
（3） 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）,。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物,、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。
（4） 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉,、安全,、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色,。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用,，應(yīng)注意防護,。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體,。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng),。通常底物作用時間,，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,，尤其是H2O2在臨用前加入,。
1. 正式試驗時,，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高,，說明有非特異性反應(yīng),，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉,。
2. 在ELISA中,，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
（1） 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體,，如聚氯乙烯,、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等,。其形式可以是凹孔平板,、試管、珠粒等,。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板,。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被,，在同一實驗條件下進行反應(yīng),，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好,。
?。?/span>2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間,。吸附溫度,，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1,、1.0和10μg／ml等）進行包被后,，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值,。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度,。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。
（3） 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）,。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物,、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。
（4） 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉,、安全,、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色,。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用,，應(yīng)注意防護,。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體,。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng),。通常底物作用時間,，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,，尤其是H2O2在臨用前加入,。
ELISA相關(guān)儀器試劑設(shè)備
· 酶標儀
· 洗板機
· 化學發(fā)光檢測儀
· ELISA檢測試劑盒
· ELISPOT檢測
· ELISA試劑盒
· 抗體
· 酶標板