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 原脫植基葉綠素（PCHLIDE）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒

使用說明書

（本試劑盒僅供體外研究使用,、不用于臨床診斷!）

聲明：尊敬的客戶,，感謝您選用本公司的產(chǎn)品。本產(chǎn)品適用于體外定量檢測血清,、血漿或其 它相關(guān)生物液體中天然和重組 原脫植基葉綠素（PCHLIDE） 濃度,。使用前請仔細(xì)閱讀說明書并檢查試劑組分,！

試劑盒組成：

特別說明：

*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整）

#:  一周內(nèi)使用可存于4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃.

相關(guān)試劑在分裝時會比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些,，請在使用時量取而非直接倒出,！

檢測原理: 本試劑盒采用競爭ELISA法。用原脫植基葉綠素（PCHLIDE）抗原包被于酶標(biāo)板上,，實(shí)驗(yàn)時樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的原脫植基葉綠素（PCHLIDE）與包 被的原脫植基葉綠素（PCHLIDE）競爭生物素標(biāo)記的抗原脫植基葉綠素（PCHLIDE）單抗上的結(jié)合位點(diǎn),，游離的成分被洗去。加入辣根過氧化物 酶標(biāo)記的親和素,，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,，游離的成分被洗去。加入顯色 底物(TMB),，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色,，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm 波長處測OD值,，原脫植基葉綠素（PCHLIDE）濃度與OD450值之間呈反比,，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中原脫植基葉綠素（PCHLIDE）的濃度。

樣品收集:

1.   血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過ye后于1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，收集 血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管,。

2.   血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2,，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可 檢測,。避免使用溶血,，高血脂樣品。

3.   組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會 影響測量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體

積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄,。 推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組 織細(xì)胞,，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,，或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,， 取上清檢測,。

4.   細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘,，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測,。

5.   其它生物樣品：1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測 具體處理方法可參考：

6.   樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除,。

7.   樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃,，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝,，凍 存于-20℃(1個月內(nèi)檢測),，或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融,。

8.   如果您的樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值,，請根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先 做預(yù)實(shí)驗(yàn),，以確定稀釋倍數(shù)）,。

試驗(yàn)所需自備物品:

1.   酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片)

2.   高精度移液器,，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.   37℃恒溫箱,，雙蒸水或去離子水

4.   吸水紙

檢測前準(zhǔn)備工作:

1.    請?zhí)崆?/span>20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫,。

2.    將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25),。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié) 晶,，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超 過50℃,，使用時洗滌液應(yīng)為室溫）,。當(dāng)日使用

3.    標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,，旋緊管蓋,， 靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次,，待其充分溶解后,，用移液器將其輕輕混勻（濃度為160pg/mL）。 然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）,。

4.    生物素化抗體工作液：實(shí)驗(yàn)前計算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以50μL/孔計）,，實(shí)際配制時應(yīng)多配

制100-200μL。使用前15分鐘,，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作 濃度。當(dāng)日使用,。

5.    酶結(jié)合物工作液：實(shí)驗(yàn)前計算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計）,，實(shí)際配制時應(yīng)多配制

100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度,。 當(dāng)日使用,。

洗滌方法:

1.    自動洗板機(jī)：每孔加入洗滌液350μL,，注入與吸出間隔60秒。

2.    手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，在潔凈的吸水紙上拍干,，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘,，吸 去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,，在厚的吸水紙上拍干,。

操作步驟:

實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫,；試劑或樣品配制時，均需充分混勻,，并盡量避免起泡,。

1.    加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 50μL,，余孔分 別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品 50μL,，立即每孔加入配好的生物素化抗體工作液 50μL（在使用前

15 分鐘內(nèi)配制）,，注意不要有氣泡,，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕 晃動混勻,。給酶標(biāo)板覆膜,，37℃孵育 45 分鐘,。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請使用新 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2.    棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板 3 次,，每次浸泡 1-2 分鐘,，大約 350μL /每孔，甩干并在吸水紙 上輕拍將孔內(nèi)液體拍干,。

3.    每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前 15 分鐘內(nèi)配制）100μL,，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。

4.    棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。

5.    每孔加底物溶液(TMB)90μL,，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實(shí)際顯 se情 況酌情縮短或延長,，但不可超過 30 分鐘,。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時,，即可終止）,。

6.    每孔加終止液 50μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的

加入順序相同,。

7.    立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀 器，設(shè)置好檢測程序,。

8.    實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結(jié)束,。

注意事項(xiàng)：

1.   保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng) 光中,。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。

2.   酶標(biāo)板：剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成 任何影響。暫時不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋,，按推薦溫度存放,！

3.   加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。每次的加樣時間控制在

10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔,。

4.   溫育：為防止樣品蒸發(fā),，實(shí)驗(yàn)時必須給酶標(biāo)板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,，避免酶標(biāo) 板處于干燥狀態(tài),；嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。

5.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸

水,。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù),。

6.   試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小,， 運(yùn)輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用前1000轉(zhuǎn)/分離心1min,，以使附著管壁或瓶蓋的 液體沉積到管底,。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻,。標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化抗體工 作液、酶結(jié)合物工作液請根據(jù)所需用量配制,，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。請 配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時,， 一次不要小于10μL），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差,；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo) 準(zhǔn)品,、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液,。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分 裝,，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復(fù)凍融,。

7.   顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘）,，如梯度已很 明顯，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù),。

8.   底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。

9.   混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要,，使用微量振蕩器(使用zui低頻率),，如無微量 振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻,。

10. 安全：試驗(yàn)中請穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作,。特別是檢測血液或者其他體液樣品 時，請按國家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行,。

11. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）

12. 試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁混用,，否則將影響試驗(yàn)結(jié)果,！

結(jié)果判斷:

1.    以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如有設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均 值計算,。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。亦可以OD值為橫坐標(biāo),， 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

2.    推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件,，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值,， 由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程 式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。

3.    若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù),。

靈敏度,、檢測范圍、特異性和重復(fù)性:

●靈敏度：zui小可測 2pg/mL,。

●檢測范圍：2–85pg/mL,。

● 特異性：可檢測重組或天然的 原脫植基葉綠素（PCHLIDE），且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

● 重復(fù)性：板內(nèi),，板間變異系數(shù)均<10%,。

聲明

1.   限于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平，尚不能對所有原料進(jìn)行全面的鑒定分析,，本產(chǎn)品可能存在 一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險,。

2.   zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),，請務(wù) 必準(zhǔn)備充足的待測樣品,。

3.   只有全部使用試劑盒內(nèi)的試劑才能保證檢測效果，不能混用其他商的產(chǎn)品,。只有嚴(yán)格

遵守實(shí)驗(yàn)說明才會得到*的檢測結(jié)果,。

4.   有效期：6 個月。

5.   本操作說明同樣適用于 48T 試劑盒,。