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Beutler改良法測定組織GSH操作規(guī)程

• 原理及意義

原理：DTNB能被-SH基團還原,，產(chǎn)生等克分子的2-硝基-5-巰基苯甲酸,，而苯甲酸陰離子在一定PH值條件下呈黃色，在412 nm波長下有吸收峰,。

意義：還原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）是一種低分子自由基清除劑,，它可清除O₂˙ 、H₂O₂,、LOOH,。GSH是蛋氨酸,、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種小分子肽，是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物,，并且是谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）兩種酶類的底物,，為這二種酶分解氫過氧化物所必需，能穩(wěn)定含巰基的酶和防止血紅蛋白及其它輔因子受氧化損傷,，zui近還證明GSH也參與使Vit E恢復(fù)到還原態(tài)的作用,。GSH測定值的高低可間接反映機體發(fā)生氧化損傷的程度。

• 器材

可見光分光計,、7 ml離心管和管架,、加樣器和槍頭

• 試劑

① 1 mmol/L的GSH（標準品）；

② 1％檸檬酸鈉,；

③ 二硫雙基苯甲酸（dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB）試劑：用1％檸檬酸鈉配成終濃度0.04％（w/v）,；

④ 20％三氯醋酸；

⑤ 0.3 mol/L磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）緩沖液,。

• 步驟

1、樣品處理及試驗步驟（下面以肝臟組織為例）

稱取一定量的肝臟組織于冰冷0.85％生理鹽水中漂洗,，濾紙吸干表面水分,，燒杯內(nèi)剪碎     制備20%組織勻漿液（須用0.85％生理鹽水或三蒸水）    4000 g離心10 min后取上清液      按上清液:20％三氯醋酸（體積比）為2:1混合（加TCA前留取20 μl上清液用于Lowry法測蛋白）     混勻，4000 g離心10 min（此步離心要充分,，可適當提高離心力）     收集上清液按表2測定,。

2、按下表1繪制標準曲線（單位：ml）

表1 GSH標準曲線的測定

混勻,，5 min內(nèi)于412nm比色,，以三蒸水調(diào)零，以標準GSH濃度為X軸,，相應(yīng)吸光值為Y軸,，繪制標準曲線，并求回歸方程,。

3,、按下表2操作測定樣品GSH（單位：ml）

表2  Beutler改良法樣品測定操作

測得的吸光值代入回歸方程，可計算出樣品液的GSH濃度,。

• 實驗結(jié)果

1,、標準曲線結(jié)果

根據(jù)上數(shù)據(jù)測得標準曲線方程為：

X(μmol)=0.3744898 Y+0.0017227（其中Y為吸光值，標準曲線看Figure 1）

Figure 1  GSH標準曲線圖

• 注意事項

• 樣品應(yīng)冰上勻漿,，所有步驟盡量保證低溫下操作,，否則結(jié)果偏低；
• 所有用水均需三蒸水,，否則結(jié)果偏低,；
• 未經(jīng)蛋白變性處理的樣品在－20℃不宜存放,；
• 反應(yīng)管內(nèi)zui終PH值必須保證在8.0～9.0間，否則結(jié)果不穩(wěn)定,；
• 配好的DTNB應(yīng)在有限期內(nèi)使用（4℃下可存1個月）,；
• GSH濃度低時顯色快，消退也快,；濃度高時顯色慢,，消退也慢，一般反應(yīng)1～5 min后測定（不要超過5 min）,；
• 反應(yīng)總體積可調(diào)為2.5 ml,。