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還原性谷胱甘肽GSH檢測方法推薦
閱讀:753 發(fā)布時間:2016-3-16提 供 商 | 上海恒遠生物科技有限公司 | 資料大小 | 47KB |
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Beutler改良法測定組織GSH操作規(guī)程
- 原理及意義
原理:DTNB能被-SH基團還原,,產(chǎn)生等克分子的2-硝基-5-巰基苯甲酸,,而苯甲酸陰離子在一定PH值條件下呈黃色,在412 nm波長下有吸收峰,。
意義:還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一種低分子自由基清除劑,,它可清除O2˙ 、H2O2,、LOOH,。GSH是蛋氨酸,、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種小分子肽,是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物,,并且是谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)兩種酶類的底物,,為這二種酶分解氫過氧化物所必需,能穩(wěn)定含巰基的酶和防止血紅蛋白及其它輔因子受氧化損傷,,zui近還證明GSH也參與使Vit E恢復(fù)到還原態(tài)的作用,。GSH測定值的高低可間接反映機體發(fā)生氧化損傷的程度。
- 器材
可見光分光計,、7 ml離心管和管架,、加樣器和槍頭
- 試劑
① 1 mmol/L的GSH(標準品);
② 1%檸檬酸鈉,;
③ 二硫雙基苯甲酸(dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB)試劑:用1%檸檬酸鈉配成終濃度0.04%(w/v),;
④ 20%三氯醋酸;
⑤ 0.3 mol/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4)緩沖液,。
- 步驟
1、樣品處理及試驗步驟(下面以肝臟組織為例)
稱取一定量的肝臟組織于冰冷0.85%生理鹽水中漂洗,,濾紙吸干表面水分,,燒杯內(nèi)剪碎 制備20%組織勻漿液(須用0.85%生理鹽水或三蒸水) 4000 g離心10 min后取上清液 按上清液:20%三氯醋酸(體積比)為2:1混合(加TCA前留取20 μl上清液用于Lowry法測蛋白) 混勻,4000 g離心10 min(此步離心要充分,,可適當提高離心力) 收集上清液按表2測定,。
2、按下表1繪制標準曲線(單位:ml)
表1 GSH標準曲線的測定
GSH(μmol/L) | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
1 mmol/L的GSH | 0 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 |
三蒸水 | 0.5 | 0.45 | 0.4 | 0.35 | 0.3 | 0.25 |
磷酸鹽緩沖液 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
DTNB試劑 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
混勻,,5 min內(nèi)于412nm比色,,以三蒸水調(diào)零,以標準GSH濃度為X軸,,相應(yīng)吸光值為Y軸,,繪制標準曲線,并求回歸方程,。
3,、按下表2操作測定樣品GSH(單位:ml)
表2 Beutler改良法樣品測定操作
試 劑 | 測定管 | 空白管 |
待測樣品液 | 0.1 | 0 |
磷酸鹽緩沖液 | 4.4 | 4.4 |
DTNB試劑 | 0.5 | 0.5 |
三蒸水 | 0 | 0.1 |
測得的吸光值代入回歸方程,可計算出樣品液的GSH濃度,。
- 實驗結(jié)果
1,、標準曲線結(jié)果
GSH濃度(μmol) | 0 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 |
A值 | 0.000 | 0.126 | 0.260 | 0.394 | 0.529 | 0.666 |
根據(jù)上數(shù)據(jù)測得標準曲線方程為:
X(μmol)=0.3744898 Y+0.0017227(其中Y為吸光值,標準曲線看Figure 1)
Figure 1 GSH標準曲線圖
- 注意事項
- 樣品應(yīng)冰上勻漿,,所有步驟盡量保證低溫下操作,,否則結(jié)果偏低;
- 所有用水均需三蒸水,,否則結(jié)果偏低,;
- 未經(jīng)蛋白變性處理的樣品在-20℃不宜存放,;
- 反應(yīng)管內(nèi)zui終PH值必須保證在8.0~9.0間,否則結(jié)果不穩(wěn)定,;
- 配好的DTNB應(yīng)在有限期內(nèi)使用(4℃下可存1個月),;
- GSH濃度低時顯色快,消退也快,;濃度高時顯色慢,,消退也慢,一般反應(yīng)1~5 min后測定(不要超過5 min),;
- 反應(yīng)總體積可調(diào)為2.5 ml,。