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怎樣制備細(xì)胞核
閱讀：224 發(fā)布時(shí)間：2015-8-26| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 152.3KB |
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細(xì)胞核制備試劑盒詳細(xì)說明
一,、 試劑盒說明
在破碎組織細(xì)胞時(shí)加入活化劑,，幫助裂解細(xì)胞，反復(fù)振蕩或使用剪切力釋放細(xì)胞核,，然后在溫和條件下低速 離心收集細(xì)胞核,。制備在 30～60 分鐘內(nèi)完成，無需特殊設(shè)備,，簡便易行,，重復(fù)性好。適用于從組織塊,、貼 壁或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制備完整的高純度細(xì)胞核,。制備的細(xì)胞核仍然保持其在細(xì)胞內(nèi)所具有的形狀和大小，是進(jìn) 行細(xì)胞核組分亞分級(jí)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)的理想材料,，是研究蛋白核轉(zhuǎn)位,、DNA-蛋白相互作用，以及進(jìn)行 Western Blot 和免疫共沉淀的理想材料,。
二,、 試劑盒組份
組份 | 50 tests | 儲(chǔ)存溫度 |
Lysis Buffer | 100 mL | 2-8℃ |
Reagent A | 10 mL | |
Medium Buffer A | 10 mL | |
Medium Buffer B | 20 mL | |
Store Buffer | 5 mL |
三、 使用注意事項(xiàng)
1. 為保證獲得完整的細(xì)胞核,，全程低溫操作,，將樣品管放在冰水浴而不是碎冰塊中?？焖偻瓿刹僮?，微量 制備比大規(guī)模制備操作更方便和快速，因而更容易獲得完整的細(xì)胞核,。
2. 破碎細(xì)胞是關(guān)鍵環(huán)節(jié),。與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞較難破壁,，必要時(shí)將勻漿混合物 3
次或多次通過 22 號(hào)針頭剪切破碎細(xì)胞,，或用小容積玻璃勻漿器,、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞
20~40 次。并不時(shí)用相差顯微鏡下檢查未裂解細(xì)胞應(yīng)少于 5%,。
3. 以離心力 g 計(jì)算正確的離心速度,，不同的離心機(jī)可據(jù)此計(jì)算離心速度。
4. 進(jìn)行 Western Blot 和 2D-膠電泳,，可先用小體積的水重懸核沉淀,，然后加入樣品緩沖液，如果直接用含 SDS 樣品緩沖液裂解核將釋放大量粘稠的 DNA 使樣品難以分散,。反復(fù)加熱變性有助于 DNA 斷裂,，可 通過細(xì)針頭反復(fù)抽吸打斷 DNA。
四,、操作方法
A. 培養(yǎng)細(xì)胞裂解
1. 貼壁細(xì)胞需要消化或機(jī)械刮下細(xì)胞,，懸浮細(xì)胞可直接離心，PBS 洗滌,，800 × g, 5min 離心收集細(xì)胞,， 計(jì)數(shù)，并估計(jì)細(xì)胞沉淀的體積,。每次提取需要 1~2 × 107 個(gè)細(xì)胞,。通常每 1 × 107 個(gè)細(xì)胞的沉淀體積約
100 μL；
2. 加入 10 倍于細(xì)胞沉淀體積的 1 mL 冰預(yù)冷的 Lysis Buffer,，振蕩重懸細(xì)胞；
3. 加入 1/20 體積約 50 μL Reagent A,，振蕩混合,；
4. 細(xì)胞懸液放冰水浴 10~20 分鐘，每 3~5 分鐘振蕩細(xì)胞 30 秒,。在相差顯微鏡下檢查游離的核應(yīng)該達(dá)到
95%而未裂解細(xì)胞應(yīng)少于 5%,。否則繼續(xù)冰浴和強(qiáng)烈振蕩，或置于玻璃勻漿器均漿數(shù)十次后再鏡檢,。
B. 組織塊破碎和細(xì)胞裂解
1. 稱取 100~500 mg 新鮮組織如肝臟,、腦，PBS 沖洗,，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi),。估計(jì)
組織塊總體積。加入 1 ml 冰預(yù)冷的 Lysis Buffer,；
2. 加入 1/20 體積約 50 μl Reagent A,，混合；
3. 上下研磨組織 20 次,。在相差顯微鏡下檢查游離的核應(yīng)該達(dá)到 95%而未裂解細(xì)胞應(yīng)少于 5%,。否則繼續(xù) 勻漿,；
4. 用濾紙或雙層紗布過濾組織勻漿裂解物。
C. 細(xì)胞核制備
1. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管,。4 oC,，1000 × g 離心 3 min 沉淀細(xì)胞核，棄上清,；
2. 用 10 倍于胞核體積（約 0.5 mL ）Lysis buffer 重懸核,，4 oC，1000 × g 離心 3 min,，棄上清,。
3. 加入 0.5 mL Medium Buffer A 重懸沉淀制成懸液；
4. 將另一預(yù)冷的新離心管內(nèi)加入 1 mL Medium Buffer B,，將步驟 3 的懸液置于 Medium Buffer B 之上,，4
oC，1000 × g 離心 10min ,，棄上清,，得較純的細(xì)胞核沉淀，此時(shí)在相差顯微鏡下細(xì)胞核應(yīng)該游離分散 在清亮背景下,；
5. 用 Store Buffer 重懸細(xì)胞核,，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或-70 oC 保存。