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豬禽流感H5N1(AIV-H5N1)酶聯(lián)免疫分析

試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用,。

96T

使用目的：

本試劑盒用于測定豬血清,、血漿及相關(guān)液體樣本中禽流感 H5N1(AIV-H5N1)表達。 實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中豬禽流感 H5N1(AIV-H5N1)表達,。用純化的禽流感

H5N1(AIV-H5N1)抗體包被微孔板,，制成固相抗體，可與樣品中禽流感 H5N1(AIV-H5N1)相 結(jié)合,，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與 HRP 標記的禽流感 H5N1(AIV-H5N1)抗 體結(jié)合,，形成抗體-抗原-抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色,。TMB 在 HRP 酶 的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標儀在 450nm 波長下測定 吸光度（OD 值）,，與 CUTOFF 值相比較,，從而判定標本中豬禽流感 H5N1(AIV-H5N1)的存 在與否。

試劑盒組成

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能 馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融

2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

操作步驟

1.     編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號,，每板應(yīng)設(shè)陰性對照 2 孔、陽性對照 2 孔,、空白對照 1

孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）

2.    加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照,、陽性對照 50μl,。然后在待測樣品孔先 加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl,。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不 觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，

3.     溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘,。

4.     配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

5.    洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置 30 秒后棄去，如此 重復 5 次,，拍干,。

6.     加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外,。

7.     溫育：操作同 3,。

8.     洗滌：操作同 5。

9.     顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl,，再加入顯色劑 B50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15 分鐘.

10.  終止：每孔加終止液 50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。

11.   測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）,。 測定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進行,。

操作程序總結(jié)：

計算和結(jié)果判定：

試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10

臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

陰性判定：樣品 OD 值< 臨界值（CUT OFF）者為禽流感 H5N1(AIV-H5N1)陰性 陽性判定：樣品 OD 值≥ 臨界值（CUT OFF）者為禽流感 H5N1(AIV-H5N1)陽性

,。

注意事項

1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。

2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未 用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果,。

4． 封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

5．底物請避光保存,。

6．試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準,，使用雙波長檢測時，參考波長為 630nm

7．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。終止液為 2M 的硫酸，使用時必須 注意安全,。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：,；2-8℃。

2．有效期：6 個月