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細胞組織蛋白提取方法
閱讀：415 發(fā)布時間：2015-7-15| 提 供 商 | 上海恒遠生物科技有限公司 | 資料大小 | 139KB |
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細胞組織蛋白提取方法
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For Research Use Only
一、 試劑盒說明
SDS 裂解液(SDS Lysis Buffer)是一種比較強烈的細胞組織裂解液,。SDS 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的
Western、ChIP(染色質(zhì)免疫共沉淀)等。SDS 裂解液的主要成分為 50mM Tris(pH8.1),，1% SDS 以及多種蛋白酶及磷酸 酶抑制劑?？梢杂行б种频鞍捉到?。
用 SDS 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,。由于含有較高濃度的去垢劑等 干擾物質(zhì)，不建議使用 Bradford 法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度,。
應(yīng)用方面：可以用于 PAGE,，Western，免疫沉淀（immunol precipitation,，IP）等,。
二、 試劑盒組份
組份 | KGP706 | KGP706-100 | 儲存溫度 |
SDS 裂解液 | 50 ml | 100 ml | 2-8℃ |
三,、操作步驟
Ⅰ 實體組織蛋白的提取
1． 在每 mL 冷 SDS 裂解液加入 10μL 100mM PMSF,，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用,。
2． 每 100mg 固體組織置于培養(yǎng)皿中,，手術(shù)剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊，加入 0.5～1 mL 冷 SDS 裂解液（如 裂解不充分可適當(dāng)添加較多的裂解液,；如需要高濃度的蛋白樣品,，可適當(dāng)減少裂解液用量），玻璃勻漿器上下手 動勻漿 15 次,，直至充分裂解,，注意低溫操作；
3． 充分裂解后,，將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管,， 10000 轉(zhuǎn)/分，4℃離心 5 min,；
4． 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中,，蛋白定量（BCA 法）；
5． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融,，即可進行后續(xù)的 Western,、ChIP 等操作。
Ⅱ 培養(yǎng)細胞蛋白提取
1．在每 mL 冷 SDS 裂解液加入 10μL 100mM PMSF,，混勻,。冰上保存數(shù)分鐘待用。
2．收集細胞,，加入裂解液,。
2.1 貼壁培養(yǎng)的細胞，吸去培養(yǎng)基后,，加入 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS 洗兩次,，每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng) 液；加入上述適量配制好的 SDS 裂解液（加量參見下表）,，用槍吹打數(shù)下,，使裂解液和細胞充分接觸,。
2.2 懸浮培養(yǎng)的細胞（或用細胞刮子刮下的貼壁細胞），將細胞及培養(yǎng)液移至離心管中,， 1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min， 再用 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS,，1000 轉(zhuǎn)/分離心 5 min 洗兩次,； 細胞洗滌后，轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中,， 加入上述適量配制好的 SDS 裂解液（加量參見下表）,，置于 4℃搖床平臺上，溫和振蕩 15 min,；
3． 充分裂解后（充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀）,， 組織勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管， 10000 轉(zhuǎn)/分,，4℃離心
5 min,；
4． 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，蛋白定量（BCA 法）,；
5． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融,，即可進行后續(xù)的 PAGE、Western,、ChIP 等操作,。
RIPA 裂解液(弱)加量參考
細胞數(shù)量 | SDS 裂解液加入量 |
107 個 | 0.5 mL～1 mL |
5×106 個 | 0.2 mL～0.5 mL |
四、注意事項
? 需自備 PMSF,。
? 所有接觸樣品的用具及試劑均需預(yù)冷,。裂解蛋白的所有步驟都需在冰浴或 4℃進行
? 提取蛋白后，如有必要,，可透析除去表面活性劑,。
? 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。