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免疫組化冰凍切片制作技巧
閱讀：221 發(fā)布時間：2015-7-1| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 202KB |
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免疫組化冰凍切片制作技巧
上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司專業(yè)做免疫學(xué)技術(shù)服務(wù)，提供免疫組化,，免疫印跡,，WB，ELSIA,，等實驗代測服務(wù),，我們
1. 從鋒利的刀片開始
我發(fā)現(xiàn)使用新的鋒利的刀片時常常做出高質(zhì)量的片子。我覺得在醫(yī)療場合中某些盡量省錢的做法顯得有些因小失大,。一般我對每位患者的標(biāo)本都使用一組新的刀片,，當(dāng)片子的質(zhì)量開始下降時，我會立刻更換刀片,。某些組織如質(zhì)地較硬的膠原和鈣化組織會使刀片很快變鈍，因此,，經(jīng)常更換刀片顯得很有必要,，有時候我在切片過程中要連續(xù)更換 2-3 次刀片。
2. 坐著還是站著
我切片時總是坐在一張凳子上,。要學(xué)會把刷子作為一種便捷的輔助工具來操作,，從而精細(xì)地控制顯微厚薄程度的片子。切片時俯身彎腰，頸部過伸的姿勢有些不妥,，要盡量處于放松和舒適的姿勢以便能zui大程度控制你的左手,。
3. 刷子
我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先學(xué)會使用刷子,。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到臺子上,。冷凍的片子會自發(fā)的卷縮并從刷子上脫離下來，因此,，我使用一把有硬毛,、夾取面寬的刷子。我發(fā)現(xiàn)來自中國的野豬毛十分堅硬,，非常管用,。你可以花 3 美元從工藝店買一把 1/4 英寸長的#2 號扁平無色的刷子，把毛削成一個角度,。由于是個有角的頭端,，加上握持刷子成一定的角度，這樣刷子與組織接觸時就會象掃帚一樣的平,。我不能理解為什么有人使用脆弱的駱駝毛刷子,，組織片很容易從這些柔軟的毛上掉下來。
4. 握持刷子
左手象拿筆一樣握持刷子,，將第五指輕壓于臺面上以穩(wěn)定握筆的手 (或根據(jù)手和切片機(jī)尺寸的大小置于你感覺合適的地方),，這樣可以保證操作者動作的靈活及可控性。我把刷子削成一個角度,，大致與左手握持刷子的角度相同,，這樣使刷子平著接觸組織的 1/4。
5. 搖柄的旋轉(zhuǎn)
以連續(xù)均勻的力量轉(zhuǎn)動切片機(jī)的搖柄,，且要毫不猶豫,。我看到很多冰凍切片者手握著刷子在開始切片時總要停一下，緩慢的抓取組織,，然后再開始轉(zhuǎn)動搖柄,。依我的經(jīng)驗看來，這種動作增加了起始切片假象的可能,，會使片子的厚度不均勻,，也增加了處理脂肪類組織的難度。我切片時,，象前面所說的那樣手握刷子,，以一種連續(xù)的動作抓取組織，這個動作與刀片接觸組織同時開始并貫穿于整個過程,。
6. 刷子的移動
組織塊移向刀片時刷子也要同步地向下移動,，當(dāng)組織塊剛好接觸刀片時刷子輕輕停在其底部 2 mm 處并迅速抽離,。正是刷子的向下移動使你能連續(xù)地抓取組織，當(dāng)開始的幾毫米組織穿過刀片時便有自發(fā)卷曲的現(xiàn)象,，這時,，運動中的刷子立刻粘住其游離的邊緣部分并水平地拖向切片者。刷子的運動路徑是一個朝下的「肘」形,，然后再朝向你自己,，連續(xù)不斷。但要注意有時候把組織壓向臺面時會使組織粘在臺面上,，可能會導(dǎo)致碎片,，應(yīng)盡量避免。當(dāng)然預(yù)先將組織包埋起來可以使刷子不用接觸到組織,，切片也容易多了,。
7. 貼片
可以從切片機(jī)的臺面上也可直接從組織塊面粘貼組織片，我一般采用前者,。片子切好后,，手持玻片在片子上方，向下以一個角度粘住片子的一角,，在靜電作用下片子會吸附在玻片上并迅速融化,。當(dāng)然在周圍涂一些包埋物對貼片有利，這種多余的包埋物可以保護(hù)片子的邊緣免受皺縮的損壞,。有時候碰到貼片困難,，我會在切到zui后2 mm 包埋物的時候停下來，讓片子留在組織塊上,，然后倒轉(zhuǎn)搖柄,，使組織塊退離刀片，再用刷子從邊緣把組織片攤平,，這樣就可以從組織塊面貼片了,，這對卷曲的片子或者脂肪組織非常管用。
8. 快速固定
我右手轉(zhuǎn)動搖柄也同時拿著玻片,，片子一切好,，立刻粘起片子并將它浸沒于固定液中。固定液需置于方便夠到的地方,，我一般將染色架放在染色缸的旁邊,，先將片子置于 95% 的乙醇溶液中固定，然后插于染色架上,。如果組織固定延遲會出現(xiàn)風(fēng)干的假象,，我的經(jīng)驗是組織片還在切片機(jī)的臺面時，風(fēng)干效應(yīng)很小,，當(dāng)組織片粘在有溫度的玻片上時就會出現(xiàn)明顯的風(fēng)干假象,，表現(xiàn)為核的細(xì)節(jié)丟失及胞漿液的溢出。下面幾張圖片是延遲 15 秒固定和立刻固定的相同組織的比較,，差異非常明顯,。
9. 切片的厚度
對于一般的手術(shù)病理我推薦切 6um 厚，這種厚度使染色更加飽滿,，層次清晰,，病理學(xué)家通常在 2x 和 4x 的放大倍數(shù)下可以獲得更多的信息。太薄的片子在這種放大倍數(shù)下顯得蒼白,，容易忽略一些細(xì)節(jié),。6um 的片子可以有更多的時間去避免風(fēng)干假象，也會減少冰晶所造成的細(xì)胞核空洞。當(dāng)然特殊情況下可能需要更厚或更薄的片子。
10. 為什么會掉片
我不能確定組織片粘附到玻片的具體機(jī)制,，但我相信可能與組織內(nèi)的液體與玻片發(fā)生分子交聯(lián)有關(guān),。下面我例出幾種染色過程中組織片脫落的情況：
1）本身非常干燥或過度脫水的組織；
2）組織片的周長與面積比過大,，象細(xì)條形的組織容易受染色缸內(nèi)液體渦旋應(yīng)力的影響而脫落，同樣包括薄的纖維囊腫及不規(guī)則的壞死組織，太厚的組織也不例外,；
3）反藍(lán)用的氨水濃度太高；
4）少數(shù)情況需要使用 100% 的乙醇固定,；
5）一張玻片貼多個片子時,，片子周圍的包埋物相互重疊。