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　　（1） 具有*靈敏度和高信噪比,，可檢測10～100 fg抗原;

　?。?） 可在日光燈下進(jìn)行發(fā)光操作;

　　（3） 發(fā)光迅速,，熒光可使X光膠片感光達(dá)12小時以上,，特別適用于痕量蛋白或核酸檢測;

　　（4） 可使用更高的抗體稀釋倍數(shù)（1:2000～1:10000）,，極其節(jié)省抗體,。

　　2. 用途：用于HRP標(biāo)記抗體的Western Blot和HRP標(biāo)記探針的核酸雜交。

　　3. 使用方法:

　?。?）執(zhí)行常規(guī)SDS-PAGE,、轉(zhuǎn)膜和Western Blot步驟。注意用HRP標(biāo)記lgG或用一抗-鏈親和素-生物素-HRP夾法,。

　?。?）Western Blotzui后一次洗膜的同時新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液A和B，放入干凈容器中混合,。建議立即使用工作液,，室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。

　?。?）用鑷子取出膜,，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜*干燥。將膜*浸入發(fā)光工作液（0.125mL發(fā)光工作液/cm2膜）中,，與發(fā)光工作液充分接觸,。室溫孵育3分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光,。孵育時間過長不會增加靈敏度,，有時還會導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應(yīng),，使用過少的發(fā)光工作液不利反應(yīng)進(jìn)行,，也會導(dǎo)致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量,。

　?。?）用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液,。

　?。?）打開X光膠片暗盒，在暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜,。將Western Blot膜貼在保鮮膜上,，將保鮮膜折起來*包裹Western Blot膜，去除氣泡和皺褶,，可剪去邊緣部多余的保鮮膜,。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋Western Blot膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi),，蛋白帶面向上,。

　　（6）暗房內(nèi)壓X光膠片,，分別曝光不同的時間如數(shù)秒到數(shù)分鐘,。顯影沖洗。

　　4. 儲存：4  ^oC密封避光保存一年以上,。短期可放置室溫,。

　　5. 安全性：無特殊毒性，按普通化學(xué)品處理,。

　　6. 注意事項：

　?。?）步驟1～5可在日光燈下操作;但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之,。戴手套可以避免在膜上留下手印,。

　　（2）長時間曝光或蛋白過量,，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系,。曝光不足則條帶模糊。

　?。?）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光,。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光,。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時間。肉眼不可見的熒光實際上可持續(xù)數(shù)小時并使X光膠片感光,，因而弱帶可曝光1-10小時,。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜,，重新孵育二抗,，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

　　（4）由于超敏發(fā)光液極其靈敏,，強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000,，二抗1:2000～1:5000?？贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶,，導(dǎo)致失敗。

　?。?）某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光,，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。

　?。?）使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可確定膠片上條帶的位置和大小,。

　　（7）NaN₃能抑制HRP活性,，回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3,，如必需使用勿超過0.01%。