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               羥脯氨酸(Hyp)檢測原理說明

（               測培養(yǎng)細(xì)胞,，培養(yǎng)液）

一、原理 羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，

根據(jù)其呈色的深淺可推算出其含量,。 二、試劑盒組成與配制：

1,、試劑一：粉劑×2 瓶,，甲液 10ml×2 瓶，乙液 20ml×2 瓶,，臨用時(shí)取粉劑一瓶,，先加 甲液混勻 10ml 充分溶解（從瓶口向內(nèi)看，*溶解完）,。然后再加乙液 20ml 充分混勻,。配好后的試劑 4℃~8℃冰箱保存。

注意點(diǎn)：粉劑加甲液 10ml 后一定一定要*溶解后才能加乙液,。

2,、試劑二：液體 60ml×1 瓶，4℃冰箱避光保存,。

3,、試劑三：粉劑×1 支，溶劑 60ml×1 瓶,，臨用時(shí)將粉劑一支加到 60ml 溶劑中充分溶解,， 配好后 4℃避光保存。

4、試劑四：羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 5mg×3 支,，4℃冰箱保存,。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制：測試前將一支標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水溶解后定溶至 50ml，配成 100μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)貯備 液,。

2μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制：取 100μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液 0.2ml 加蒸餾水定溶至 10ml,，配成 2μg/ml

的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

5,、消化液：粉劑×1 瓶，溶劑 3ml×1 瓶,，4℃冰箱保存,。臨用前將粉劑倒入溶劑中，并 用溶劑將粉劑瓶洗干凈,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

*注意：混勻時(shí)用雙手小心旋動(dòng)小瓶，切勿上下顛倒混勻,，以免引起大量氣泡,。

三、操作步驟：

1,、樣本前處理：（血清及體液可直接進(jìn)行檢測,，組織則需制成勻漿后檢測。） 組織塊稱重,，放在勻漿管口部,，用小剪刀剪碎，加入 9 倍生理鹽水沖入勻稱管

中,，緩慢上下旋轉(zhuǎn)研磨,，每次半分鐘，間隔半分鐘,，反復(fù) 5 次或者用勻漿機(jī),，勻漿時(shí)間

10 秒/次，間隔 30 秒,，連續(xù) 3~5 次,，在冰水中進(jìn)行。勻漿后以 3500 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘,， 取上清 0.1ml 加 0.4ml 生理鹽水,，稀釋成 2%的組織勻漿進(jìn)行檢測，或者取 0.05ml 10%勻 漿加生理鹽水 0.45ml 制備成 1%勻漿,，請做預(yù)試后再確定勻漿濃度,。（詳見實(shí)驗(yàn)方法學(xué)）,。

2、消化：

	空白管	標(biāo)準(zhǔn)管	測定管
雙蒸水（ml）	0.25
2μg/ml 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 （ml）		0.25
檢測液（ml）			0.25
消化液（ml）	0.05	0.05	0.05

3,、羥脯氨酸測定：

混勻,，37℃水浴 3 小時(shí)

試劑一（ml）

0.5

0.5

0.5

混勻，室溫靜置 10 分鐘

試劑二（ml）

0.5

0.5

0.5

混勻,，室溫靜置 5 分鐘

試劑三（ml）

1.0

1.0

1.0

混勻,，60℃水浴 15 分鐘，流水冷卻后,，3500 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘,，取上清（注

意不要混入下面沉淀）在 550nm 處，1cm 光徑,，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度,。

注意：若您的樣本中所含羥脯氨酸過低,，可以增加您的樣本取樣量或增加勻漿濃度。

4,、蛋白定量,。

四、計(jì)算與舉例：

1,、公式：

如需詳細(xì)的檢測說明原理,，請下載資料，同時(shí)我司客服人員,，我們會(huì)為你提供的產(chǎn)品與技術(shù)服務(wù)