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一次實(shí)驗(yàn)，四種作用：用四唑鹽比色法實(shí)驗(yàn)查看細(xì)胞的生長與其存活
閱讀：1683 發(fā)布時(shí)間：2014-3-6 實(shí)驗(yàn)有其目的有其原理,，您看題目知道我們本次的實(shí)驗(yàn)是查看細(xì)胞的生長存活，我們今天使用的方法名稱為四唑鹽比色法,，四唑鹽也叫MTT,。本次實(shí)驗(yàn)有些特別哦！實(shí)驗(yàn)的作用出標(biāo)題中目的,，還有兩個(gè),，它還可以大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定,、生物活性因子的活性檢測,。
一次實(shí)驗(yàn)，四種作用：用四唑鹽比色法實(shí)驗(yàn)查看細(xì)胞的生長與其存活,。在實(shí)驗(yàn)之前您需要先了解一下應(yīng)該明確知道哪些問題,，當(dāng)然啦，上海恒遠(yuǎn)已經(jīng)為您整理出來了,，下面我們來分條逐步看：
1,、選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下,，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞,。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前,，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線,，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間,，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣,，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系,。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異,。
2,、藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn),，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩,。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。不然可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間,。
3,、時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測定OD值,，輸入excel表,，zui后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線,，曲線什么時(shí)候變得平坦了那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是的時(shí)間點(diǎn),，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的zui明顯。
4,、培養(yǎng)時(shí)間,。200 ul的培養(yǎng)液對于10的4~5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68 h,，如果營養(yǎng)不夠的話,，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果,，我們是在48 h換液的,。
5、MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力,，不能測定細(xì)胞數(shù),。做MTT時(shí)，盡量無菌操作,，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高,。
6、理論未必都是對的,。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整,。
7,、實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔,，加藥孔,。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT,、二甲基亞砜,。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液,、MTT,、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì),，而加藥組加入不同濃度的藥物,。
8、避免血清干擾,。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),，高的血清物質(zhì)會影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加,，會試驗(yàn)敏感性,。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行,。在呈色后,，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
第二部是貼壁細(xì)胞：
1,、收集對數(shù)期細(xì)胞,，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 ul,，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1 000-10 000孔,，邊緣孔用無菌PBS填充。
2,、5% CO2,，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,，加入濃度梯度的藥物,，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥,，或兩小時(shí),，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥,。一般5-7個(gè)梯度,，每孔100 ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè),，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況,。
3、5% CO2,，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察,。
4,、每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT）,，繼續(xù)培養(yǎng)4 h,。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液,，小心用PBS沖2-3遍后,，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
5,、終止培養(yǎng),，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
6,、每孔加入150 ul二甲基亞砜,，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解,。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值,。
7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基,、MTT,、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞,、相同濃度的藥物溶解介質(zhì),、培養(yǎng)液、MTT,、二甲基亞砜）,。
做完了貼壁細(xì)胞之后，我們再看看懸浮細(xì)胞：
1,、收集對數(shù)期細(xì)胞,，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)?br />① 補(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40 ul ；
② 加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲存液100 ug/ml,，需預(yù)試尋找*稀釋度,，1：10-1：20）；
③ 需檢測物10 ul,；
④ 細(xì)胞懸液50 ul（即5×104cell/孔）,，共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100 ul 1640）,。
2,、置37℃，5% CO2孵育16-48小時(shí),，倒置顯微鏡下觀察,。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,，即0.5% MTT）,，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1,，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4）,，直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）
4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min）,，小心吸掉上清,，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min,，使結(jié)晶物充分溶解,。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。
5,、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基,、MTT、二甲基亞砜）,，對照孔（細(xì)胞,、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液,、MTT,、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔,。
MTT的配制：一般現(xiàn)用現(xiàn)配,，過濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存,，避免反復(fù)凍融,，小劑量分裝,，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解,。我一般都把MTT粉分裝在EP管里,，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加,，沒必要一下子配那么多,，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就不能再用了。
上海恒遠(yuǎn)提醒您：MTT有致癌性,，用的時(shí)候小心,，有條件帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無菌,，MTT對菌很敏感,；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短,，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.
配制MTT時(shí)用PBS溶解，也有人用生理鹽水配,，60℃水浴助溶,。
1、PBS配方
① NaCl ：8 g,。
② KCl 0.2：g,。
③ Na2HPO4 ：1.44 g。
④ KH2PO4：0.24 g,。
⑤ 調(diào)pH7.4,。
⑥ 定容1 L。
zui后一步啦,，細(xì)胞的接種（鋪板）：
細(xì)胞過了30代以后就不要用了,，因?yàn)闋顟B(tài)不好了；培養(yǎng)板要用好的（進(jìn)口板）,，不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn),。接種時(shí)按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度接種， 因?yàn)榧?xì)胞密度在10000/ml左右時(shí),，所測得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系,，結(jié)果zui可信。如果鋪的太稀細(xì)胞的殺傷不會很明顯,，太密細(xì)胞可能都會凋亡,，因?yàn)榧?xì)胞長的太快營養(yǎng)會不夠，zui后導(dǎo)致死亡,。且而細(xì)胞過密或者過少,，增殖都會過快或者過慢,，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用10000/ml,，100 ul/孔,。
細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來定.如果你做的藥品對細(xì)胞具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細(xì)胞濃度，如果你做的藥品對細(xì)胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細(xì)胞濃度,，這樣與對照的區(qū)別更明顯,，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105,，貼壁細(xì)胞可為103-104,。
到這里就算是基本說完了，本實(shí)驗(yàn)有點(diǎn)復(fù)雜,，所以朋友們要小心并且有耐心哦,！zui后呢，上海恒遠(yuǎn)在這里再給朋友們說說實(shí)驗(yàn)中有哪些注意事項(xiàng),。首先就要選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度,，還有要避免血清干擾，一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn),，在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液,。設(shè)空白對照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗(yàn)步驟保持一致,，zui后比色以空白調(diào)零,。MTT實(shí)驗(yàn)吸光度zui后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系,，IC50是半抑制率,，意思是抑制率50％的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度,，然后計(jì)算各自的抑制率,，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖,，然后得到50％抑制率時(shí)候的藥品濃度,，就是IC50。
一次實(shí)驗(yàn),，四種作用,。感謝您對本公司的支持，我公司的產(chǎn)品質(zhì)量都是可以保證的,，并且試劑盒提供免費(fèi)代測,，其它產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)中，您有任何問題都可以來電,，我們可提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo),。歡迎您電詢上海恒遠(yuǎn)何,。