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細胞DNA轉(zhuǎn)染方法
閱讀：2533 發(fā)布時間：2013-6-6細胞DNA轉(zhuǎn)染方法
對于大部分的細胞系,， DNA與DNAfect的比例在1:2至1:3時轉(zhuǎn)染效率較高,。為了提高轉(zhuǎn)化效率,、表達水平并且減少細胞毒性,，實驗應(yīng)在細胞密度較大時進行轉(zhuǎn)染,。以下操作以24孔板每孔細胞的DNA轉(zhuǎn)染操作為例,。
1. 貼壁細胞：轉(zhuǎn)化前一天,，在24孔板的每孔中加入500 μl無抗生素的生長培養(yǎng)基，并于每孔中接種0.5-2×105個細胞,，待細胞長至80-90%滿時進行轉(zhuǎn)染,。
懸浮細胞：在細胞轉(zhuǎn)染之前，在24孔板的每孔中加入500 μl無抗生素的生長培養(yǎng)基,，并于每孔中接種3-5×105
個細胞,。
2. 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，首先準備轉(zhuǎn)染復(fù)合物,，對于每孔細胞按照以下用量配制：
a. 取適量DNA,，加入25 μl無血清培養(yǎng)基，并輕輕的混合均勻,。
b. 取適量DNAfect,，加入25 μl無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻,，并于室溫孵育5分鐘,。
c. 孵育5分鐘之后，將稀釋的DNA和稀釋的DNAfect混合（使DNA以及DNAfectin的終總體積為50 μl）,，輕輕 混合均勻,，并在室溫下孵育20分鐘（溶液可能會出現(xiàn)絮狀，但不會影響轉(zhuǎn)染效率） 注意：該混合物在室溫下可以穩(wěn)定保存6小時,。
3. 將步驟1中24孔板中培養(yǎng)的細胞生長培養(yǎng)基更換成450 μl無血清培養(yǎng)基,，然后將步驟2中50 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到
24細胞孔板內(nèi)，輕輕前后推動24孔板以混勻,。
4. 將細胞置于含5%CO2,，37℃條件下培養(yǎng)4-6小時后，更換成500 μl生長培養(yǎng)基,。
5. 18-48小時后進行轉(zhuǎn)染基因表達的檢測,。
6. 對于穩(wěn)定的細胞系：在轉(zhuǎn)染24小時后，細胞按照1:10的比例傳代,，第二天可加入篩選培養(yǎng)基進行篩選,。
注：（1） 該說明為一個24孔的用量，若同時轉(zhuǎn)幾個孔,，配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物的量需加倍,；若轉(zhuǎn)染其他類型孔板，DNA和DNAfect用量見附表,，該附表用量以293T細胞為轉(zhuǎn)染細胞時的標準用量,。
（2） 轉(zhuǎn)染4-6小時后也可以不更換生長培養(yǎng)基，但由于DNAfect具有一定的細胞毒性,，作用時間過長可能使某些細胞出現(xiàn)大量死亡現(xiàn) 象,，建議更換生長培養(yǎng)基,。
（3） 優(yōu)化條件：想要得到更高的轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件：培養(yǎng)物,、DNA濃度,、細胞數(shù)和細胞與DNA復(fù)合物的孵育時間等條件都 應(yīng)進行優(yōu)化。