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多糖多酚植物RNA提取的利器
閱讀：2344 發(fā)布時(shí)間：2012-11-6多糖多酚植物RNA提取的利器
許多植物由于未能有效地分離純化出其組織中的RNA,， 而阻礙了其分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)展,。比如Northern雜交分析,，體外翻譯分析或建cDNA文庫,，RT-PCR及差異顯示分析等研究,，都需要高質(zhì)量的RNA,。因此，提取純度高,、完整性好的RNA是順利進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵所在,。
酚類化合物的干擾
許多植物組織特別是果實(shí)（如蘋果、櫻桃,、李子,、葡萄等）及樹木類植物中富含酚類化合物。隨著植物的生長(zhǎng),，酚類物質(zhì)的含量也會(huì)增加,，因此幼嫩的植物才是*的提取材料。此外,，針葉類植物的針葉中多酚的含量要比落葉植物的葉子中高很多,。
植物材料經(jīng)過前期的破碎處理后，酚類物質(zhì)會(huì)釋放出來,，氧化（見下圖）后處理液變?yōu)楹稚?，并隨氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)（browning effect）,。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA不可逆地結(jié)合,，導(dǎo)致RNA活性喪失,，而在用苯酚,、氯仿抽提時(shí)，RNA還會(huì)丟失或形成不溶性復(fù)合物,，從而影響RNA的分離純化,。Newbury等還發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易與材料中酚類化合物總量之間并無直接相關(guān)性，而是與所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）有關(guān),。
次級(jí)代謝產(chǎn)物的干擾
許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級(jí)代謝產(chǎn)物,，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性RNA的分離。因不能確定這些次級(jí)產(chǎn)物具體是什么物質(zhì),，所以,，目前還沒有什么特殊的方法來*解決這個(gè)問題,。
次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生過程
小結(jié)
植物組織特別是高等植物組織，組成成分復(fù)雜多樣,，因此植物組織RNA的提取相對(duì)于其它生物材料來說要困難的多,。因此單一試劑確實(shí)很難將植物組織提取中的所有問題都很好解決，因此這就需要有專門的科研人員或試劑生產(chǎn)商投入大量的精力和財(cái)力進(jìn)行深入的研究,，進(jìn)而開發(fā)出方便實(shí)用的試劑盒來,。
縱觀上RNA提取的試劑盒，如常見的TRIzol,，以及一些的RNA提取試劑盒均很難從多糖多酚的植物中提取高質(zhì)量的RNA,。
Trizol主要成份是異硫氰酸胍和苯酚，沒有特殊去除多糖和多酚的試劑,，所以對(duì)于大多數(shù)多糖多酚的植物無法成功提取,，即使添加了如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸之類的防止酚氧化的試劑也很難提取,。RNeasy Plant Mini Kit主要裂解液是鹽酸胍或則異硫氰酸胍,，有些公司進(jìn)行改進(jìn)之后添加了諸如PVP40等結(jié)合多酚的試劑，亦無法取得讓人滿意的結(jié)果,。
百泰克公司在RNA提取方面積累了豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),，開發(fā)出通用植物總RNA快速提取試劑盒（貨號(hào)：RP3301或RP3302），使客戶幾乎不需要再查很多相關(guān)的資料,，不需要花很多的時(shí)間和精力去尋找提取合適植物樣品的試劑盒,！在百泰克所試驗(yàn)的一百多例多糖多酚植物中，無一例外地提取出來高質(zhì)量的RNA,，其中包括棉花,、蘋果、葡萄,、草莓,、香蕉、龍眼,、荔枝,、番茄果實(shí)、茄子,、松針,、楊樹、擬南芥種子,、菠蘿蜜,、馬蹄金、早熟禾,、高羊茅,、云杉,、松樹、紫椴,、花楸,、白樺、山毛櫸,、海棠花,、槭槭、紫羅蘭,、毛爪草,、丁香、月季,、天竺葵,、仙客來、菊花,、牽?；ā⒆纤晒?、彩葉草,、一品紅、夾竹桃,、垂葉榕等,。
通用植物總RNA快速提取試劑盒特點(diǎn)如下：
l 高品質(zhì)的進(jìn)口吸附膜 極大程度上減小了其它進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)吸附膜所造成的柱與柱之間吸附能力的差異，保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性
l *的結(jié)合抽提液 性能穩(wěn)定,、純度高,，可極大程度提高結(jié)合效率，從而為RNA的得率打下良好的基礎(chǔ)
l 離心柱型 簡(jiǎn)便快捷,，不需要再采用傳統(tǒng)的異丙醇沉淀和乙醇洗滌,，簡(jiǎn)化操作步驟，提高實(shí)驗(yàn)效率,。同時(shí)也可避免提取物過渡干燥不易溶解的問題
l 自主研發(fā)漂洗液 可以有效消除基因組污染,，提高RNA純度
多糖的干擾
多糖是植物RNA提取時(shí)另一常遇問題。植物組織中往往富含多糖,，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似,，因此很難將它們分開,。
如果要去除多糖,，RNA也會(huì)隨機(jī)被帶走，造成RNA得率降低,；而沉淀RNA時(shí),，也往往產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀,，這種沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液,，所以也很難有效地將其與RNA分開,。另外多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究,。在常規(guī)的方法中,，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下,，通過苯酚,、氯仿抽提也可以除去一些多糖；此外還可以通過LiCl沉淀RNA將部分多糖留在上清液中,。但即使通過這些步驟仍會(huì)發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起,，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時(shí)多糖污染的問題。
RNA提取的常見難點(diǎn)
研究表明,，一些植物組織之所以比較難提取出高質(zhì)量的RNA與這些植物組織中富含的一些成份有關(guān),，常見的有酚類化合物，多糖以及某些尚無法確定的次級(jí)代謝產(chǎn)物,，另外還有就是富含較高活性RNase的組織,。在完整的細(xì)胞內(nèi)，這些物質(zhì)與核酸是分離的,，一旦細(xì)胞破碎,，這些物質(zhì)就會(huì)與RNA相互作用。