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技術(shù)文章
肝臟細(xì)胞RNA的提取原理
閱讀：3096 發(fā)布時(shí)間：2012-10-18
一．原理
RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能基因組學(xué)科研技術(shù)的重要基礎(chǔ),。從RNA水平研究生物體內(nèi)基因的調(diào)控機(jī)制，已成為分子生物學(xué)研究的一個(gè)重要手段。對(duì)某一生物或組織進(jìn)行性狀研究,，首先要獲得該性狀基因，從組織細(xì)胞中分離完整的RNA對(duì)于分子克隆和基因表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)是至關(guān)重要的,，如Northern印跡及雜交分析,、cDNA合成等實(shí)驗(yàn)的成效在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。利用提取的RNA人們可以對(duì)特定的基因表達(dá)進(jìn)行定量的檢測,，從分子水平的了解細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律,。通常一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含有10-5μgRNA，其中80%～85%為rRNA（主要是28S、18S和5.8S,、5S四種類型）,；10%～15%為tRNA和核內(nèi)小分子RNA。
這些高峰度的RNA的大小和序列確定,，可通過凝膠電泳,、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析（HPLC）分離,。相反,，占RNA總量1%～5%的為mRNA。mRNA雖然大小和核苷酸序列各不相同,，從數(shù)百至數(shù)千堿基不等,，但大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在其3''端均有一寡聚腺苷酸（polyA）組成的尾，其長度一般足以吸附于寡聚脫氧胸苷酸―纖維素[oligo（dT）],，使得mRNA可以利用親和層析法分離,。這個(gè)群體編碼了所有由該細(xì)胞合成的多肽。研究表明RNA極不穩(wěn)定,，易于降解,，而RNA酶幾乎無處不在，且特別穩(wěn)定,，故在提取RNA時(shí)關(guān)鍵因素是zui大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力,，因此，創(chuàng)造一個(gè)無RNA酶的環(huán)境,，嚴(yán)格防止RNA酶污染是成功提取RNA的關(guān)鍵,。
對(duì)內(nèi)源性RNA酶，主要運(yùn)用RNA酶抑制劑,，目前常用的RNA酶抑制劑有：
?、賀NA酶的蛋白質(zhì)抑制劑（RNasin），它是從人胎盤分離的一種蛋白質(zhì),，可以與多種RNA酶緊密結(jié)合形成非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物,，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑制品經(jīng)數(shù)次凍融后或放在氧化條件下應(yīng)棄之不用,。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無細(xì)胞體系中的翻譯,；
②氧釩核糖核苷復(fù)合物,，它是由氧釩離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復(fù)合物,，是一種過渡態(tài)似物，它能與多種RNA酶結(jié)合并抑制RNA酶活性,。然而氧釩核糖核苷復(fù)合物能強(qiáng)烈抑制mRNA在無細(xì)胞體系中的翻譯,，因此必須用含0.1%羥基喹啉的苯酚多次抽提以除之；
③硅藻土,，硅藻土能吸附RNA酶,，并且在后續(xù)的RNA純化過程中經(jīng)離心除去；
?、墚惲蚯杷犭?，它是強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，在破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從細(xì)胞核中解離出來的同時(shí)也使RNA酶變性失活,；
⑤焦碳酸二乙酯（DEPC）,，它是RNA酶強(qiáng)烈抑制劑,，但其作用并不是的。DEPC主要用于不能高壓滅菌的材料和器皿的RNA酶處理,；
?、奁渌瘜W(xué)試劑，如SDS,、尿素等對(duì)RNA酶也有一定的抑制作用,。
對(duì)外源性RNA酶主要通過以下幾個(gè)途徑污染RNA制品：
①玻璃制品,、塑料制品和電泳槽,；
②研究人員造成的污染,；
?、畚廴镜娜芤骸?br />
因此在實(shí)驗(yàn)中必須采取下列措施抑制外源性RNA酶：
?、賹?shí)驗(yàn)室用的普通玻璃制品和塑料制品經(jīng)常有RNA酶污染,，使用前必須于180℃干烤3h以上（玻璃制品）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h,，然后用滅菌水淋洗數(shù)次,，并于100℃干烤15min。RNA電泳槽需用去污劑洗滌,，用水沖洗,，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min,，然后用0.1%DEPC水*沖洗電泳槽,。滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不需要處理,；
?、谠赗NA提取過程中,應(yīng)戴一次性手套,對(duì)接觸可能污染的器皿時(shí)，應(yīng)勤換手套；
?、叟渲频娜芤簯?yīng)盡可能用0.1%DEPC水在37℃處理12h以上,，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。對(duì)不能高壓滅菌的試劑,，用經(jīng)DEPC水配制處理過的無菌蒸餾水配制,，然后用0.22μm濾膜過濾除菌。
真核細(xì)胞總RNA制備方法有多種,，包括異硫氰酸胍—氯化銫超速離心法,、鹽酸胍—有機(jī)溶劑法、氯化鋰—尿素法以及熱酚法,、異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法以及TRIzol試劑提取法等,。目前實(shí)驗(yàn)室提取總RNA的常用方法為異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol試劑提取法。異硫氰酸胍法制備真核細(xì)胞總RNA,，是將已知zui強(qiáng)的RNase酶抑制劑異硫氰酸胍,、β-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用，抑制了RNA的降解,，增強(qiáng)了核蛋白復(fù)合物的解離,，使RNA和蛋白質(zhì)分離并進(jìn)入溶液，RNA選擇性地進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相,，容易被異丙醇沉淀濃縮,。
二．材料與方法
1材料
實(shí)驗(yàn)魚，購于市場,。
2儀器,、用具
臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋（70℃）,、分析天平,、移液器、一次性注射器,、方盤,、鑷子、手術(shù)剪,、培養(yǎng)皿,、1.5ml離心管。
3試劑
95%的RNase-free乙醇,；0.1%DEPC處理水,；SVRNALysisBuffer；SVRNAdilutionBuffer,；SVRNAWashSolution,；YellowcoreBuffer,；MnCl2；0.09M,；DNaseⅠ,；SVDNaseStopSolution；Nuclease-Freewater,。
4方法
1）材料的準(zhǔn)備
?。?）將培養(yǎng)皿、剪刀,、眼科鑷滅菌,，-20℃預(yù)冷。
?。?）用泡沫盒盛裝碎冰,，將培養(yǎng)皿置于冰上，將剪刀,、鑷子置于培養(yǎng)皿中。
?。?）用桶盛裝碎冰,，加入少量的自來水，用紗布包裹魚放入桶中,。
?。?）將已麻痹的魚置于方盤中，用剪于肛門向前及斜向上將腹腔剪開,，取出內(nèi)臟,，分離肝臟置于培養(yǎng)皿中。
?。?）取1.5ml的離心管于分析天平上,，調(diào)零。
?。?）用鑷子取20-30mg的肝臟組織于1.5ml的離心管中,，稱重。
2）實(shí)驗(yàn)操作
?。?）取約30mg組織于1.5ml離心管中,，加入175μlSVRNALysisBuffer，用一次性注射器將組織壓碎,、反復(fù)抽打混勻,。
（2）加350μlSVRNADilutionBuffer（藍(lán)色）,，翻轉(zhuǎn)管子3-4次混勻,，置70℃水浴3min,。
（3）冰上冷卻1-2秒,，14000rpm離心10min,，上清液移入一新離心管。
?。?）加入200μl95%的乙醇,，槍頭混勻。
?。?）將上述混合液移入SpinBasketAssembly,，14000rpm離心1min，棄濾液,。
?。?）加入600μlSVRNAWashSolution（withethandadded），14000rpm離心1min,，棄濾液,。
（7）在一新離心管中配制DNaseincubationmix：
YellowCoreBuffer40μl
MnCl20.09M5μl
DNaseⅠ5μl
?。?）將上述50μl混合液直接加在SpinBasket的膜上,，室溫（20-25℃）保育15min。
?。?）加200μlSVDNaseStopSolution（withethandadded）至SpinBasket14000rpm,，離心1min。
?。?0）加600μlSVRNAWashSolution,，14000rpm離心1min，棄濾液,。
YellowcoreBuffer40μlMnCl2,，0.09M5μlDNaseI5μl
（11）加250μlSVRNAWashSolution,，14000rpm離心2min,，將SpinBasket轉(zhuǎn)移到一新離心管中。
?。?2）加50μlNuclease-FreeWater至膜上,，14000rpm離心1min，溶解RNA,，-20℃保存,。
（13）取5μlRNA樣品,，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量,。
上海恒遠(yuǎn)ELISA試劑盒供應(yīng)商是一家生物技術(shù)企業(yè),，公司集經(jīng)銷批發(fā)ELISA試劑盒,人ELISA試劑盒，大鼠ELISA試劑盒,，小鼠ELISA試劑盒為一體的有限責(zé)任公司,，是一家經(jīng)國家相關(guān)部門批準(zhǔn)注冊的企業(yè)。ELISA試劑盒,生物試劑,進(jìn)口培養(yǎng)基,胎牛血清,抗體等產(chǎn)品已國內(nèi)大部分地區(qū),，銷售額逐年穩(wěn)步上升,。
RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能基因組學(xué)科研技術(shù)的重要基礎(chǔ),。從RNA水平研究生物體內(nèi)基因的調(diào)控機(jī)制，已成為分子生物學(xué)研究的一個(gè)重要手段。對(duì)某一生物或組織進(jìn)行性狀研究,，首先要獲得該性狀基因，從組織細(xì)胞中分離完整的RNA對(duì)于分子克隆和基因表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)是至關(guān)重要的,，如Northern印跡及雜交分析,、cDNA合成等實(shí)驗(yàn)的成效在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。利用提取的RNA人們可以對(duì)特定的基因表達(dá)進(jìn)行定量的檢測,，從分子水平的了解細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律,。通常一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含有10-5μgRNA，其中80%～85%為rRNA（主要是28S、18S和5.8S,、5S四種類型）,；10%～15%為tRNA和核內(nèi)小分子RNA。
這些高峰度的RNA的大小和序列確定,，可通過凝膠電泳,、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析（HPLC）分離,。相反,，占RNA總量1%～5%的為mRNA。mRNA雖然大小和核苷酸序列各不相同,，從數(shù)百至數(shù)千堿基不等,，但大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在其3''端均有一寡聚腺苷酸（polyA）組成的尾，其長度一般足以吸附于寡聚脫氧胸苷酸―纖維素[oligo（dT）],，使得mRNA可以利用親和層析法分離,。這個(gè)群體編碼了所有由該細(xì)胞合成的多肽。研究表明RNA極不穩(wěn)定,，易于降解,，而RNA酶幾乎無處不在，且特別穩(wěn)定,，故在提取RNA時(shí)關(guān)鍵因素是zui大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力,，因此，創(chuàng)造一個(gè)無RNA酶的環(huán)境,，嚴(yán)格防止RNA酶污染是成功提取RNA的關(guān)鍵,。
對(duì)內(nèi)源性RNA酶，主要運(yùn)用RNA酶抑制劑,，目前常用的RNA酶抑制劑有：
?、賀NA酶的蛋白質(zhì)抑制劑（RNasin），它是從人胎盤分離的一種蛋白質(zhì),，可以與多種RNA酶緊密結(jié)合形成非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物,，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑制品經(jīng)數(shù)次凍融后或放在氧化條件下應(yīng)棄之不用,。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無細(xì)胞體系中的翻譯,；
②氧釩核糖核苷復(fù)合物,，它是由氧釩離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復(fù)合物,，是一種過渡態(tài)似物，它能與多種RNA酶結(jié)合并抑制RNA酶活性,。然而氧釩核糖核苷復(fù)合物能強(qiáng)烈抑制mRNA在無細(xì)胞體系中的翻譯,，因此必須用含0.1%羥基喹啉的苯酚多次抽提以除之；
③硅藻土,，硅藻土能吸附RNA酶,，并且在后續(xù)的RNA純化過程中經(jīng)離心除去；
?、墚惲蚯杷犭?，它是強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，在破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從細(xì)胞核中解離出來的同時(shí)也使RNA酶變性失活,；
⑤焦碳酸二乙酯（DEPC）,，它是RNA酶強(qiáng)烈抑制劑,，但其作用并不是的。DEPC主要用于不能高壓滅菌的材料和器皿的RNA酶處理,；
?、奁渌瘜W(xué)試劑，如SDS,、尿素等對(duì)RNA酶也有一定的抑制作用,。
對(duì)外源性RNA酶主要通過以下幾個(gè)途徑污染RNA制品：
①玻璃制品,、塑料制品和電泳槽,；
②研究人員造成的污染,；
?、畚廴镜娜芤骸?br />
因此在實(shí)驗(yàn)中必須采取下列措施抑制外源性RNA酶：
?、賹?shí)驗(yàn)室用的普通玻璃制品和塑料制品經(jīng)常有RNA酶污染,，使用前必須于180℃干烤3h以上（玻璃制品）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h,，然后用滅菌水淋洗數(shù)次,，并于100℃干烤15min。RNA電泳槽需用去污劑洗滌,，用水沖洗,，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min,，然后用0.1%DEPC水*沖洗電泳槽,。滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不需要處理,；
?、谠赗NA提取過程中,應(yīng)戴一次性手套,對(duì)接觸可能污染的器皿時(shí)，應(yīng)勤換手套；
?、叟渲频娜芤簯?yīng)盡可能用0.1%DEPC水在37℃處理12h以上,，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。對(duì)不能高壓滅菌的試劑,，用經(jīng)DEPC水配制處理過的無菌蒸餾水配制,，然后用0.22μm濾膜過濾除菌。
真核細(xì)胞總RNA制備方法有多種,，包括異硫氰酸胍—氯化銫超速離心法,、鹽酸胍—有機(jī)溶劑法、氯化鋰—尿素法以及熱酚法,、異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法以及TRIzol試劑提取法等,。目前實(shí)驗(yàn)室提取總RNA的常用方法為異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol試劑提取法。異硫氰酸胍法制備真核細(xì)胞總RNA,，是將已知zui強(qiáng)的RNase酶抑制劑異硫氰酸胍,、β-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用，抑制了RNA的降解,，增強(qiáng)了核蛋白復(fù)合物的解離,，使RNA和蛋白質(zhì)分離并進(jìn)入溶液，RNA選擇性地進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相,，容易被異丙醇沉淀濃縮,。
二．材料與方法
1材料
實(shí)驗(yàn)魚，購于市場,。
2儀器,、用具
臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋（70℃）,、分析天平,、移液器、一次性注射器,、方盤,、鑷子、手術(shù)剪,、培養(yǎng)皿,、1.5ml離心管。
3試劑
95%的RNase-free乙醇,；0.1%DEPC處理水,；SVRNALysisBuffer；SVRNAdilutionBuffer,；SVRNAWashSolution,；YellowcoreBuffer,；MnCl2；0.09M,；DNaseⅠ,；SVDNaseStopSolution；Nuclease-Freewater,。
4方法
1）材料的準(zhǔn)備
?。?）將培養(yǎng)皿、剪刀,、眼科鑷滅菌,，-20℃預(yù)冷。
?。?）用泡沫盒盛裝碎冰,，將培養(yǎng)皿置于冰上，將剪刀,、鑷子置于培養(yǎng)皿中。
?。?）用桶盛裝碎冰,，加入少量的自來水，用紗布包裹魚放入桶中,。
?。?）將已麻痹的魚置于方盤中，用剪于肛門向前及斜向上將腹腔剪開,，取出內(nèi)臟,，分離肝臟置于培養(yǎng)皿中。
?。?）取1.5ml的離心管于分析天平上,，調(diào)零。
?。?）用鑷子取20-30mg的肝臟組織于1.5ml的離心管中,，稱重。
2）實(shí)驗(yàn)操作
?。?）取約30mg組織于1.5ml離心管中,，加入175μlSVRNALysisBuffer，用一次性注射器將組織壓碎,、反復(fù)抽打混勻,。
（2）加350μlSVRNADilutionBuffer（藍(lán)色）,，翻轉(zhuǎn)管子3-4次混勻,，置70℃水浴3min,。
（3）冰上冷卻1-2秒,，14000rpm離心10min,，上清液移入一新離心管。
?。?）加入200μl95%的乙醇,，槍頭混勻。
?。?）將上述混合液移入SpinBasketAssembly,，14000rpm離心1min，棄濾液,。
?。?）加入600μlSVRNAWashSolution（withethandadded），14000rpm離心1min,，棄濾液,。
（7）在一新離心管中配制DNaseincubationmix：
YellowCoreBuffer40μl
MnCl20.09M5μl
DNaseⅠ5μl
?。?）將上述50μl混合液直接加在SpinBasket的膜上,，室溫（20-25℃）保育15min。
?。?）加200μlSVDNaseStopSolution（withethandadded）至SpinBasket14000rpm,，離心1min。
?。?0）加600μlSVRNAWashSolution,，14000rpm離心1min，棄濾液,。
YellowcoreBuffer40μlMnCl2,，0.09M5μlDNaseI5μl
（11）加250μlSVRNAWashSolution,，14000rpm離心2min,，將SpinBasket轉(zhuǎn)移到一新離心管中。
?。?2）加50μlNuclease-FreeWater至膜上,，14000rpm離心1min，溶解RNA,，-20℃保存,。
（13）取5μlRNA樣品,，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量,。
上海恒遠(yuǎn)ELISA試劑盒供應(yīng)商是一家生物技術(shù)企業(yè),，公司集經(jīng)銷批發(fā)ELISA試劑盒,人ELISA試劑盒，大鼠ELISA試劑盒,，小鼠ELISA試劑盒為一體的有限責(zé)任公司,，是一家經(jīng)國家相關(guān)部門批準(zhǔn)注冊的企業(yè)。ELISA試劑盒,生物試劑,進(jìn)口培養(yǎng)基,胎牛血清,抗體等產(chǎn)品已國內(nèi)大部分地區(qū),，銷售額逐年穩(wěn)步上升,。