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ELISA中非特異性顯色原因分析
閱讀：1869 發(fā)布時間：2012-9-18上海恒遠生物科技有限公司專業(yè)供應(yīng)各種屬elisa試劑盒,，提供免費代測服務(wù),，保證實驗結(jié)果客觀真實性,。我公司對試劑盒質(zhì)量100%保證,，若存在質(zhì)量問題,，我們無條件包退換。若需要了解試劑盒的詳細信息,，請：： 業(yè)務(wù): 何
影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,如試劑盒特異性,、檢驗標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物,操作過程中的問題.本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度,從而提高檢測的特異性,并得到更準(zhǔn)確、可靠的實驗結(jié)果.
1,、試劑盒特異性因素
1.1 固相載體的選擇.ELISA中常用的固相載體有微量滴定板,、小珠和小試管三種,以微量滴定板zui為常見[1].它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近.聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大.因此,在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證,評估.
1.2包被物的純度.在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度.目前由于技術(shù)條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性.目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原.
1.3包被抗體的效價.具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面.
1.4 封閉.是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾.
2,、檢驗標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2.1內(nèi)源性干擾物:類風(fēng)濕因子（RF）、黃疸等,類風(fēng)濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,多數(shù)為IgM類,能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),從而呈現(xiàn)非特異性顯色.
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶,如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物,就有可能產(chǎn)生非特異性顯色.
2.2 外源性干擾物,常常因樣品采集,、貯存,、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,被細菌污染,標(biāo)本凝集不全等.溶血標(biāo)本,紅細胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色.如有細菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過氧化酶）[2],有國內(nèi)報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標(biāo)本時可造成假陽性[3].如在冰箱中保存過久,其中的IgG可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深[2].因此,血標(biāo)本在采集處理時應(yīng)小心,在冰箱中保存不易過久.
標(biāo)本凝集不全時,血清中會殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽性.
3,、操作過程中的問題造成假陽性
3.1加樣
對于間接ELISA標(biāo)本一般都要進行稀釋,如果加樣不準(zhǔn)就會造成誤差,尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時,很小的誤差,會導(dǎo)致較大的相對誤差,使陰性（或弱陽性）標(biāo)本呈陽性（或陰性）.加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡.目前,大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,可較好地避免以上誤差.
3.2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,應(yīng)引起操作者重視.無論是手工操作還是機器操作,得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的.通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì).
3.3 溫育
每種試劑都有其*反應(yīng)模式,其中溫度和溫育時間控制是重要因素.因孵育溫度高,反應(yīng)時間長,會造成整板本底高,陽性率高.溫育一般用濕盒或水浴,反應(yīng)板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋.
3.4酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測定結(jié)果的儀器,酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,決定結(jié)果的可靠度.首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進行保養(yǎng),對濾光片要定期校正;其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確,使用雙波長,一個檢測波長,一個參比波長,以消除微孔板底部劃痕、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾.此外,在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時先擦試微孔板底部并壓平板條.由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,使用中應(yīng)詳細閱讀說明書
綜上所述,由于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標(biāo)準(zhǔn)化,盡管目前上以及我國有了部分標(biāo)準(zhǔn)血清或參比血清（血清盤）.但由于受方法學(xué)及技術(shù)條件的限制,在酶聯(lián)吸附測定中有時不可避免的會出現(xiàn)一定的非特異性,但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底,從而提高檢測的特異性,并得到更準(zhǔn)確,、可靠的實驗結(jié)果.
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