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用于流式細胞 儀檢測的常用熒光素有FITC、TRITC,、Cy3,、Cy5，PE和PI，在以上各種熒光染料中,，PE熒光zui強,，適用于弱表達抗原；FITC*,，適用于強表達抗原,，適用范圍廣。

1．直接免疫熒光標記法

取一定量的細胞懸液（濃度約1×10⁶ 個/ml）,，直接加入熒光素標記抗體進行免疫反應（如做雙重標記或多重標記染色,，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入）。4℃孵育15～30分鐘后,，用1/15mol/LPBS（pH 7.2～7.4）洗1～2次,，加入緩沖液重懸，上機檢測,。

本方法操作簡便,，結果準確，易于分析,，適用于同一細胞群多參數(shù)同時測定,。雖然直接熒光抗體標記試劑成本較高。但減少了間接標記法中較強的非特異熒光干擾,，因此更適用于臨床標本的檢測,。

2．間接免疫熒光標記法

取一定量的細胞懸液（濃度約5×10⁶ 個/ml）,，加入特異性*抗體,，4℃孵育15～30分鐘，待反應*后用磷酸緩沖液洗去未結合抗體,，吸盡殘留液體,，再加入熒光標記第二抗體，4~C孵育30分鐘,，抗原―抗體―抗抗體復合物,，洗滌后即可上機檢測。注意：在整個熒光標記過程中均需參考免疫熒光細胞化學間接法染色程序,，尤其是加入一抗前需使用正常非免疫血清封閉,，以減少非特異性反應。如果對于未經(jīng)固定的細胞需使用0.3%TritonX-100為細胞膜打孔,，以保證抗體能夠進入細胞內(nèi),。

此法費用較低，二抗應用廣泛,，多用于科研樣品檢測,。但是，由于非特異性熒光背景較強,，

影響實驗結果,，在樣品制備時應加人陰性或陽性對照,。另外，由于間接法步驟較多,，尤其是經(jīng)過多次洗滌,，均可使細胞數(shù)量驟減，因此,，在加入*抗體前細胞懸液的細胞濃度約5×10⁶個/ml,，上機檢測前不少于1×10⁶ 個/ml即可，此法不適用測定細胞數(shù)較少的樣品,。

3．熒光標記中的注意事項

① 為減少非特異性干擾,，熒光標記物用前應用0．22um濾膜過濾或高速離心5分鐘，以除去顆?；虺猎?。

② 細胞樣品的制備、染色及保存均應該盡量保持新鮮,，防止分解代謝引起的表面抗原消失及細胞死亡,，可以通過加入營養(yǎng)培養(yǎng)基或低濃度血清以及4~0或冰浴中操作來解決。

③ 細胞或低比例細胞亞群分析時,，為保證準確,，應排除死細胞。

④ 熒光標記抗體濃度應該合適,，如果濃度過高,，會使非特異性結合增加。在使用一抗之前,，將樣品與過量的牛血清白蛋白（BSA）或來源于同一種屬的正常血清一起孵育,，以阻斷一抗和細胞表面或胞內(nèi)結構非特異性作用。在使用一抗之后,，將樣品,、與二抗相同種屬的5%～10%正常血清和二抗一起孵育，以減少二抗與一抗,、細胞表面或胞內(nèi)結構之間的非特異相互作用,。如果使用含有與一抗或二抗種屬相同的血清液體稀釋抗體，便可以省略此步驟,。