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做山羊環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)?實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)
閱讀：1236 發(fā)布時(shí)間：2022-8-3注意：使用前請(qǐng)檢查試劑盒中試劑的標(biāo)簽和數(shù)量與表格是否一致。
需要但未提供的材料及耗材
1,、酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
2,、精密移液器、吸頭,、加樣槽
3,、蒸餾水或去離子水
4、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)
5,、37℃水浴鍋或恒溫箱
6,、EP管
7、無(wú)粉一次性乳膠手套
【儲(chǔ)存條件及有效期】
1,、2-8℃保存,，切勿冷凍，有效期6個(gè)月,。
2,、開(kāi)封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中,，密閉自封袋,，并將全部試劑放回2-8℃冰箱,。
注意：試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用,；使用后的剩余試劑盒建議在實(shí)驗(yàn)后1 個(gè)月內(nèi)使用完畢,。產(chǎn)品過(guò)期時(shí)間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的,。
【適用儀器】
半自動(dòng)的酶標(biāo)儀，如Thermo MK3,，或者國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)儀,。
【樣本要求】
1.樣本類型和采集
血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置0.5-2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
細(xì)胞裂解液: 吸棄培養(yǎng)液,，用PBS（0.01 M，pH 7.4）將細(xì)胞洗一遍,。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞（不能用胰酶和EDTA 處理）,，加入2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）。懸浮細(xì)胞可省略,。收集細(xì)胞懸液,，4℃ 1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基,，用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗3次,。加入適量的預(yù)冷PBS或非變性細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞,通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞量需要150-250μL PBS重懸。 將樣品放入-20℃或-80℃,，使樣品冷凍,，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融3次,，使細(xì)胞充分裂解,也可將樣品進(jìn)行超聲破碎,，以達(dá)到裂解的目的。4℃ 10000×g 離心10min,，除去細(xì)胞碎片,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.樣本保存和穩(wěn)定性
樣本在2-8℃條件下,，可以儲(chǔ)存72h,，在- 20℃或-80℃可以儲(chǔ)存6個(gè)月及以上。樣本收集后,，不是一次檢測(cè)完,，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融,。
【注意事項(xiàng)】
1. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值）,，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
2. 封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。
3. 為免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管,。
4. 要嚴(yán)格避免操作過(guò)程中酶標(biāo)板干燥,。干燥會(huì)使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活,。
5. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),。
6. 顯色時(shí)間供參考,，因用戶實(shí)驗(yàn)室條件差異，最佳顯色時(shí)間會(huì)有所不同,。
7. 所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
8. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用,。
9. 揭封板膜和覆蓋封板膜時(shí)應(yīng)避免用力過(guò)大導(dǎo)致液體濺出,。
【結(jié)果計(jì)算】
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。