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細(xì)胞裂怎么辦?
閱讀：1245 發(fā)布時(shí)間：2021-1-18關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：
1.融解ripa裂解液，混勻。取恰當(dāng)量的裂解液,，在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加pmsf，使pmsf的終濃度為1mm,。
2.關(guān)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液,，用pbs、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(假如血清中的蛋白沒(méi)有干擾,，能夠不洗),。按照6孔板每孔參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。用槍吹打數(shù)下,，使裂解液和細(xì)胞充沛接觸,。一般裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解,。
關(guān)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞,，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液,。再用手指輕彈以充沛裂解細(xì)胞,。充沛裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉積。假如細(xì)胞量較多,，必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管,，然后再裂解。
3.充沛裂解后,，10000-14000g離心3-5分鐘,，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的page,、western和免疫沉積等操作,。
裂解液用量說(shuō)明：一般6孔板每孔細(xì)胞參加150微升裂解液現(xiàn)已足夠，但假如細(xì)胞密度十分高能夠恰當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升,。
關(guān)于安排樣品：
1.把安排剪切成細(xì)微的碎片,。
2.融解ripa裂解液，混勻,。取恰當(dāng)量的裂解液,，在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加pmsf，使pmsf的終濃度為1mm,。
3.按照每20毫克安排參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液,。(假如裂解不充沛能夠恰當(dāng)增加更多的裂解液，假如需求高濃度的蛋白樣品,，能夠恰當(dāng)減少裂解液的用量,。)
4.用玻璃勻漿器勻漿，直至充沛裂解。
5.充沛裂解后,，10000-14000g離心3-5分鐘,，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的page,、western和免疫沉積等操作,。
6.假如安排樣品本身十分細(xì)微，能夠恰當(dāng)剪切后直接參加裂解液裂解,，通過(guò)激烈vortex使樣品裂解充沛,。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)試驗(yàn),。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便,，不用運(yùn)用勻漿器，缺陷是不如運(yùn)用勻漿器那樣裂解得比較充沛,。
注：ripa裂解液的裂解產(chǎn)品中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)通明膠狀物,，屬正常現(xiàn)象,。該通明膠狀物為含有基因組dna等的復(fù)合物,。在不檢測(cè)和基因組dna結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，能夠直接離心取上清用于后續(xù)試驗(yàn),；假如需求檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,，則能夠通過(guò)超聲處理打碎打散該通明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)試驗(yàn),。假如檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，例如nf-kappab,、p53等時(shí),，一般不用進(jìn)行超聲處理，就能夠檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子,。