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ELISA試劑盒顯色和比色的方法有什么不同
閱讀：1854 發(fā)布時(shí)間：2020-3-3ELISA試劑盒顯色和比色的方法
（1） 顯色
顯色是ELISA中的zui后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物有色的產(chǎn)物,。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素,。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色,，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng),。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中,，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確,。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制,，有時(shí)可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯se情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時(shí)間,，及時(shí)判斷,。 OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深,，再延長反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高,。OPD底物液受光照會自行變色,，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng),。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色,。 TMB受光照的影響不大,，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果,。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果,。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá),，隨即逐漸減弱,，至2小時(shí)后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種,，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止,。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑,。此外，各類酸性終止液則會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色,，此時(shí)可用特定的波長（450nm）測讀吸光值,。
（2） 比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn),，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中,，才可進(jìn)行比色,。在加底物液顯色前,，先將軟板邊緣剪凈,，這樣，此板就可*平妥坐入座架中,。 比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn),，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況,。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,，然后進(jìn)行計(jì)算,。 比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD）,，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A）,，兩者含義相同,。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角,，如OPD的吸收波長為492nm,，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。
（3） 酶標(biāo)比色儀
酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀,，通常指于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。針對固相載體形式的不同,，各有特制的適用于板,、珠和小試管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀,。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度,、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、度和可測范圍,、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可到0.001,，準(zhǔn)確性為±1%,，重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說,，若某孔測得的A值為1.083,，則該孔相對于空氣的真實(shí)A值應(yīng)為1.083±0.01（1.073~1.093），重復(fù)測定數(shù)次,，其A值均應(yīng)1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶標(biāo)儀的可測范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同,。普通的酶標(biāo)儀在0.000~2.000,，新型號的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá)2.900，甚至更高,。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同,，線性范圍常小于可測范圍,，比如某一酶標(biāo)儀的可測范圍為0.000~2.900,，而其線性范圍僅0.000~2.000,，這在定量ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意,。 酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15~30℃,，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘,，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。
測讀A值時(shí),，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀,，即每孔先后測讀兩次，其次在zui適波長（W1）,，第二次在不敏感波長（W2）,，兩次測定間不移動ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1,，630nm為W2,，zui終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾,。