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些生化試劑的原理
閱讀：1220 發(fā)布時(shí)間：2020-1-141．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,，因而具有溶菌的作用,。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí),，溶菌酶作用受到抑制,。
葡萄糖：增加溶液的粘度,，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解,。
EDTA：（1）螯合Mg2＋,、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在,，有利于溶菌酶的作用,，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5,，小于9的溶液中,，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH＞12或pH＜3時(shí),，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性,。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時(shí),，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6,，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。
SDS：SDS是離子型表面活性劑,。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白,，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白,。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物,，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,，所以在以后的提取過(guò)程中,，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾,。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：
NaAc的水溶液呈堿性,，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸,。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液,。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性,，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性,，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA,、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之,。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后,，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物,，使沉淀更*。
4．為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA,？
用無(wú)水乙醇沉淀DNA,，這是實(shí)驗(yàn)中常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶,，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng),，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑,。
DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在,，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿?，使DNA失水而易于聚合,。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合,，其乙醇的終含量占67％左右,。因而也可改用95％乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大,，而DNA在溶液中有一定程度的溶解,，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí),，就會(huì)影響收得率,。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95％乙醇代替無(wú)水乙酵，后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇,。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA,。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。
5．在用乙醇沉淀DNA時(shí),，為什么一定要加NaAc或NaCl至終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L,？
在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的,，加一定濃度的NaAc或NaCl,，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的tong性電荷相斥力,，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí),，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合,，這樣就造成DNA沉淀不*,，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好,。在沉淀的DNA中,，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng),，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀,。
6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來(lái)處理,？
加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì),，為了純化DNA，又必須去除之,，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀,，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加*,。也可用飽和酚,、氯f(wàn)ang抽提再沉淀，去除RNase,。在溶液中,，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果,。
7．為什么在保存或抽提DNA過(guò)程中,，一般采用TE緩沖液？
在基因操作實(shí)驗(yàn)中,，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用,。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液,，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí),，磷酸根離子的種類(lèi)及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時(shí),，不同的酶對(duì)輔助因子的種類(lèi)及數(shù)量要求不同,，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度,，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng),，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用,，故在提取或保存DNA時(shí),，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性,。
8．如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來(lái)沉淀DNA,？
采用PEG（6000）沉淀DNA,，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低,，選擇性沉淀DNA分子量大,，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20％,。本實(shí)驗(yàn)選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA,，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其終PEG濃度為12％,。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp,。
9．抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯f(wàn)ang較好,？
酞與氯f(wàn)ang是非極性分子,，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯f(wàn)ang混合時(shí),，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯f(wàn)ang擠去,，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心,，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大,，因而與水相分離，沉淀在水相下面,，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi),。而酚與氯f(wàn)ang有機(jī)溶劑比重更大，保留在下層,。
作為表面變性的酚與氯f(wàn)ang,，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊,，酚的變性作用大,，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中,，因而損失了這部分水相中的DNA,，而氯f(wàn)ang的變性作用不如酚效果好，但氯f(wàn)ang與水不相混溶,，不會(huì)帶走DNA,。所以在抽提過(guò)程中，混合使用酚與氯f(wàn)ang效果hao,。經(jīng)酚次抽提后的水相中有殘留的酚,，由于酚與氯f(wàn)ang是互溶的，可用氯f(wàn)ang第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走,。也可以在第二次抽提時(shí),，將酚與氯f(wàn)ang混合（1:1）使用。
10.為什么用酚與氯f(wàn)ang抽提DNA時(shí),，還要加少量的異戊酵？
在抽提DNA時(shí),，為了混合均勻,，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡,，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用,。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生,。一般采用氯f(wàn)ang與異戊酵為24：1之比,。也可采用酚、氯f(wàn)ang與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制,，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯f(wàn)ang與異戊醇即成）,，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相,，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定,。