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    非特異染色的原因包括一抗和二抗與血清蛋白的相互作用，抗體與組織之間的離子相互作用,，以及與能夠影響IHC檢測系統(tǒng)的內(nèi)源分子的相互作用,。這些問題會產(chǎn)生高背景，以及無法在適當(dāng)?shù)募?xì)胞位置觀察目的抗原,。這種類型的染色問題可通過用封閉劑來封閉非特異相互作用來解決,。在將樣本與一抗共同孵育之前，可開展這些步驟

    預(yù)防非特異疏水相互作用

    盡管疏水相互作用在抗原表位-抗體的結(jié)合中起了重要作用,，但這些力同樣能促進非特異結(jié)合,。由于一些氨基酸的中性側(cè)鏈，大部分蛋白有著某種程度的疏水性,。將組織與熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白（BSA）共同孵育,，是降低非特異疏水結(jié)合的常用步驟。正常血清類型的選擇對預(yù)防與一抗或二抗的相互作用,，或預(yù)防與待染色組織/細(xì)胞的相互作用很重要,。例如，在使用山羊來源的一抗時,，不建議用山羊血清作為封閉劑,。而是推薦與二抗的宿主動物相同的血清或來自不相關(guān)物種的血清。BSA和脫脂奶粉常用作封閉劑,。這些試劑通常包含在一抗和二抗的稀釋液中,。非離子去污劑如0.3% Triton X-100?或Tween 20?的添加也能降低非特異疏水相互作用。

    預(yù)防非特異離子相互作用

    如果使用的抗體與目的組織有著相反的凈電荷,，那么離子相互作用可能導(dǎo)致非特異的背景染色,。例如，非特異染色可能來自相反的羧基和氨基相互作用,。范德華力,、兩級分子間的弱靜電相互作用也能起作用。增加固定劑和/或抗體稀釋液的離子強度能降低離子相互作用,。不過,，表位-抗體結(jié)合通常依賴于離子強度，因此這種方法也可能負(fù)面影響染色特異性,。由于單克隆抗體的單表位特異性,，與多克隆抗體相比,，增加離子強度更可能損害其性能。

    內(nèi)源酶的干擾

    顯色檢測法常使用一種結(jié)合的酶來觀察表位-抗體的相互作用,。在使用這種檢測方法時,，同一種酶的內(nèi)源活性必須被封閉。例如,，包含辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的操作步驟可能需要試劑來防止非特異信號,。腎、肝或帶有紅細(xì)胞的血管區(qū)域等組織含有內(nèi)源的過氧化物酶活性,。由3-10% H2O2配制而成的過氧化物酶封閉液能用于防止內(nèi)源的過氧化物酶切割底物。