化工儀器網(wǎng)
公司動(dòng)態(tài)
關(guān)于小鼠肝組織DNA的提取
閱讀：3297 發(fā)布時(shí)間：2013-1-11實(shí)驗(yàn)原理
真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中,，因此制備DNA必須先粉碎組織,，裂解細(xì)胞膜和核膜，使核蛋白釋放,，在除去蛋白質(zhì),、脂類、糖類和 RNA等物質(zhì),，得到純化的DNA,。在本實(shí)驗(yàn)的提取DNA反應(yīng)體系中，SDS（十二烷基磺酸鈉）破壞細(xì)胞膜和核膜,，并使蛋白質(zhì)變性,，將核蛋白中的DNA與蛋白質(zhì)分開，EDTA及SDS抑制細(xì)胞中的DNA酶的活性,。用酚,、氯仿抽提的方法進(jìn)一步除去蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀除凈小分子化合物,。提取出的 DNA制品進(jìn)一步用含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳加以鑒定,。
主要試劑
1. 生理鹽水
2. 裂解緩沖液
3. 苯 酚：氯 仿混合液（1：1）
4. 無水乙醇
5. 70％乙醇
6. TE緩沖液
7. 溴酚藍(lán)載樣液
8. 溴乙錠溶液
9. TBE緩沖液
主要設(shè)備
1. 研缽
2. 研缽棒
3. 刻度離心管
4. 普通離心機(jī)
5. 小試管
6. Ep管
實(shí)驗(yàn)材料
小鼠
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 處死小鼠，迅速取出小鼠肝臟,，用生理鹽水洗去附著血液,，用濾紙吸干血水后稱量0.5g肝實(shí)質(zhì)組織放于研缽中。
2. 研缽中加入1ml裂解緩沖液,、少量石英砂,，研磨至勻漿，再加入2ml繼續(xù)研磨至勻漿,。
3. 取刻度離心管一支,，加肝勻漿至1.0ml，再加入等體積苯酚：氯仿混合液抽提,，每次抽提以中等大小的力來回振蕩5min,，然后離心 3000r/min，10min,，水相吸入另一干凈的小試管中,，抽提重復(fù)3次。
4. 往乘有上水相的小試管中加入2.5倍體積的冷無水乙醇,，輕輕混勻,，此時(shí)可見有白色絮狀沉淀，此即DNA粗制品,。
5. 將試管中的上清液倒出,，保留沉淀。用70％的乙醇洗滌沉淀2次,，洗滌時(shí)動(dòng)作要輕柔,，同上法棄上清保留沉淀,。
6. 加入0.25mlTE緩沖液溶解沉淀。
7. 取30ml沉淀溶解液放入Ep管中,。
8. 向Ep管中加入溴酚藍(lán)載樣液5ml,，混勻后即為鑒定所用樣品。
9. 取瓊脂糖0.3g,，TBE緩沖液15ml加入錐形瓶中,，加熱錐形瓶使瓊脂糖充分熔解后，加入10ml溴乙錠,，混勻后將膠液倒入已放置樣孔梳的膠板上,。
10. 待膠板凝好后拔去樣孔梳，取15ml樣品液加入樣孔槽中,。
11. 將加好樣品液的膠板放入乘有TBE緩沖液的電泳槽中,，樣孔槽位于陰極側(cè)，蓋好電泳槽蓋后通電,，調(diào)節(jié)電壓100V電泳40-60min,。
12. 泳畢，拿出膠板,，在紫外光燈下觀察結(jié)果,。
注意事項(xiàng)
1. 吸水相時(shí)不要將界面上的變性蛋白質(zhì)混入，抽提3次后一般有機(jī)相和水相界面上的變性蛋白質(zhì)極少,，肉眼基本看不見,，若變性蛋白質(zhì)仍較多，可增加抽提次數(shù),。實(shí)驗(yàn)中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短,，并燒成鈍口。
2. zui后一次棄上清時(shí),，盡可能去盡上清,。