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牛腫瘤壞死因子α檢測(cè)報(bào)告
閱讀：689 發(fā)布時(shí)間：2013-3-11| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 108.6KB |
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牛（Cattle）腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 檢測(cè)試劑盒
本試劑僅供研究使用 標(biāo)本：血清或血漿
| 試驗(yàn)原理： TNF-α試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知TNF-α濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將TNF-α和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP,。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,，然后加入底物A,、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用,。產(chǎn)生顏色,。顏色的深淺和樣品中TNF-α的濃度呈比例關(guān)系。 試劑盒內(nèi)容及其配制：
自備材料： 1． 蒸餾水,。 2． 加樣器：5ul,、10ul、50ul,、100ul,、200、500ul,、1000ul,。 3． 振蕩器及磁力攪拌器等。 4． 樣品收集,、處理及保存方法： 1,、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。 | | 2、 血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽,、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。 3,、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。 4,、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎,。1000×g離心10分鐘，取上清液 5,、 保存------如果樣品不立即使用,，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒,，檢測(cè)前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。 操作注意事項(xiàng)： l 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存,，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,，不可保存,。 l 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存,，以免變質(zhì),。 l 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用,。 l 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A,、B液時(shí),，避免使用帶金屬部分的加樣器。 l 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。 l 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感,，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下,。避免用手接觸，有毒,。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值,。 l 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣,。 l 按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間,、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。 |
| 安全性： 1． 避免直接接觸終止液和底物A,、B,。一旦接觸到這些液體，請(qǐng)盡快用水沖洗,。 2． 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝,、抽煙或使用化妝品。 3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。 試劑的準(zhǔn)備： 1． 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備,，不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進(jìn)行：
2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋,。 試劑盒性能： 1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品,。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990,。 2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng),。 3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%,。 | | 操作步驟： 1． 使用前,，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,，產(chǎn)生加樣上的誤差。 2． 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。 3． 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育45分鐘。 4． 甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次,。 5． 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘,。 6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作4次,。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。 7． 每孔加入底物A,、B各50ul,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育5分鐘。避免光照,。 8． 取出酶標(biāo)板,，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果,。 9． 在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值,。 結(jié) 果 判 斷 與 分 析： 1、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值 2,、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y）,，相應(yīng)的TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線,，樣品的TNF-α含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度, 再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。 3,、檢測(cè)值范圍：0-400pg/ml 4,、敏感度： 0.1 pg/ml |