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“恒遠(yuǎn)生物”產(chǎn)品文獻(xiàn)：滋陰補陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征
閱讀：596 發(fā)布時間：2019-4-24滋陰補陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征（ＰＣＯＳ）大鼠卵巢顆粒細(xì)胞（ＧＣ）分泌功能和細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響
徐括琴１,，尹巧芝２,，黨麗英１,，侯玉華１，楊小風(fēng)１
１．鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科（鄭州４５００００）,，２．成都中醫(yī)藥大學(xué)婦科教研室（成都６１００７５）
摘 要 目的：研究滋陰補陽方序貫療法對多囊卵巢綜合征（ＰＣＯＳ）大鼠卵巢顆粒細(xì)胞（ＧＣ）分泌功能和細(xì)胞因子基因表達(dá)產(chǎn)生的影響,。方法：利用隨機數(shù)字表法將實驗雌性性ＳＤ 大鼠分為３ 組，包括空白對照組,、滋陰組以及補陽組,；選取６ 周齡同樣大鼠灌胃,，調(diào)配空白血清與用藥血清,；對ＰＣＯＳ大鼠 ＧＣ 及黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),，并以隨機方法分為１０組，比較各組細(xì)胞培養(yǎng)液里
面雌二醇（Ｅ２）,、類胰島素增長因子（ＩＧＦ－１）,、干細(xì)胞因子（ＳＣＦ）以及睪酮（Ｔ）水平，并觀察ＳＣＦ ｍＲ－ ＮＡ 表達(dá)情況,。結(jié)果：模型組１ＧＣ 里面 Ｅ２ 水平明顯低于對照組（Ｐ ＜０．０５）,，且 ＳＣＦ 水平明顯高于
對照組；滋陰方組２ＳＣＦ 與滋陰方組３ＳＣＦ 水平均明顯低于模型組１（Ｐ ＜０．０５）,，而滋陰方組２Ｅ２
與滋陰方組３Ｅ２水平均明顯高于模型組１（Ｐ＜０．０５）,；模型組１大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)明顯高于對照組，且ＩＧＦ－１灰度值明顯小于對照組（Ｐ＜０．０５）,，滋陰方組２ 與滋陰方組３ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)均顯著低于模型組１（Ｐ＜０．０５）,，滋陰方組３ＩＧＦ－１ 灰度值明顯高于模型組１（Ｐ ＜０．０５）；模型組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞里面Ｔ 水平明顯高于對照組（Ｐ＜０．０５）,；補陽方組２與補陽方組３Ｔ水平明顯低于模型組（Ｐ＜０．０５）,，而補陽方組１Ｔ 水平與模型組的比較無顯著差異（Ｐ＞０．０５）；對照組,、模型組,、補陽方組黃素化顆粒細(xì)胞里面ＳＣＦ 水平、ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)以及ＩＧＦ－１灰度值比較無顯
著差異（Ｐ＞０．０５）,。結(jié)論：對ＰＣＯＳ采取滋陰補陽方序貫療法,，能提高 ＧＣ 分泌功能，同時可以降低卵泡期ＳＣＦ 基因在體內(nèi)的表達(dá)實現(xiàn),，可為ＰＣＯＳ排卵障礙臨床治療提供依據(jù),。
主題詞 多囊卵巢綜合征／中醫(yī)藥療法 ＠滋陰補陽方 大鼠 動物，實驗
中圖分類號：Ｒ７３７．３１ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊｉ．ｓｓｎ．１０００－７３６９．２０１７．０７．０８３
多囊卵巢綜合征（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃｏｖａｒｉａｎｓｙｎｄｒｏｍｅ,，ＰＣＯＳ）是與各器官,、系統(tǒng)正常內(nèi)分泌紊亂相關(guān)的疾病，患者臨床表現(xiàn)具 有多樣化特點,，現(xiàn)今其病理機制缺乏統(tǒng)一結(jié)論,。有報道指出， 育齡婦女群體 ＰＣＯＳ發(fā)病率高達(dá)５％ ～１０％ ,，并且和７５％ 左右無排卵性不孕患者密切相關(guān)［１］,。亦有研究顯示，部分卵巢局部調(diào)節(jié)因子的表達(dá)和 ＰＣＯＳ 發(fā)病存在緊密聯(lián)系［２］,。干細(xì)胞因子
（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ,，ＳＣＦ）屬于卵巢局部相對重要的一種生長因子，可對細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生促進(jìn)作用。現(xiàn)階段,，與 ＳＣＦ 在 Ｐ－ ＣＯＳ患者卵巢局部產(chǎn)生的促進(jìn)作用相關(guān)研究較多,，可是涉及ＳＣＦ 在 ＰＣＯＳ臨床發(fā)病機制中作用的研究卻不多。本文以大鼠實驗,，探討滋陰補陽方序貫療法對 ＰＣＯＳ 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞
（ＧＣ）分泌功能和ＳＣＦ 基因表達(dá)產(chǎn)生的影響,，現(xiàn)匯報如下。
材料與方法
１ 動物 選?。福?nbsp;只雌性 ＳＤ 大鼠,，每只日齡均為２１ 日，體重為４０～５０ｇ,；另選?。担爸淮菩裕樱?nbsp;大鼠，每只６周齡,，并且體重為１７０～１８０ｇ,，所有大鼠均清潔級飼養(yǎng)，給予自然光照,，控制室溫不超過２０ ℃ ～２５ ℃范圍,。
２ 藥物與主要試劑 由武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展公司提供脫氫表雄酮（ＤＨＥＡ）；浙江田雨藥用油有限公司提供實驗注射大豆油,；滋陰方組成成分為：紫河車,、熟地黃、菟絲子,、當(dāng)歸,、白芍以 及山茱萸等中藥；補陽方組成成分為：yin羊藿,、黨參,、補骨脂、巴 戟天以及川續(xù)斷等,?；旌弦陨现兴?，置于水中浸泡１ｈ 后,，采用武火煮沸，然后用文火煮 ２０ ｍｉｎ,，將其過濾,，并且重復(fù)煎 ２
次，后合并濾液,，置于５５ ℃ ～６０ ℃水浴條件下濃縮,。實驗給藥量依據(jù)人鼠劑量［３］進(jìn)行換算，其中滋陰方含生藥量為 ２．４８ ｇ／ｋｇ，對于補陽方,，則含生藥量為２．２０ｇ／ｋｇ,，并將煎劑冷卻后放在４℃ 溫度下保存。
由 ＨｙＣｌｏｎｅ公司提供 ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培養(yǎng)基,、胰蛋白酶,，由 ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ 公司提供１０％ 胎牛血清；北京賽百盛生物工程公司提供ＳＣＦ 與 β－ａｃｔｉｎ 引物,，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供
ＥＬＩＳＡ 試 劑 盒,；Ｂｉｏ－Ｔｅｋｅ 公 司 提 供 ＲＮＡ 提 取 試 劑 盒，,；
ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ,，ＴａｋａＲａ公司；上海博升生物科技有限公司提供孕馬血清促性腺激素（ＰＭＳＧ）,，并由上海生物化學(xué)制藥廠提供人絨毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）,。
３ 實驗方法
３．１ 構(gòu)建實驗 ＰＣＯＳ 大鼠模型：對８４ 只雌性 ＳＤ 大鼠進(jìn)行編號，將其隨機分成模型組（ｎ＝６７）與空白對照組（ｎ＝１７）,。 ８４只大鼠全部在２１ｄ 齡斷乳,，實驗開始第１ 天為適應(yīng)性喂養(yǎng)進(jìn)行２ｄ后，即在２３ｄ 齡,，模型組每天需定時在其頸背部采取
皮下注射方式予以６ ｍｇ／１００ｇ 的 ＤＨＥＡ 以及０．２ ｍｌ量的注射用大豆油,，并對對照組每天在頸背部采取皮下注射方式予以０．２ ｍｌ量的注射用大豆油，均持續(xù)應(yīng)用１ 月,。模型組大鼠在注射第２０ｄ需要每天獲取其陰道涂片,，通過陰道涂片了解到大鼠正在動情間期，沒有動情周期變化以及排卵現(xiàn)象,；２ 組均在第 ３０ｄ進(jìn)行眼眶靜脈采血,，其中模型組大鼠血清激素睪酮水平升高表示造模成功，本實驗有７只造模失敗必須剔除,。
３．２ 分裂并且培養(yǎng)顆粒細(xì)胞：在第３１ 天需對每只大鼠采取頸部皮下注射方式予以 ＰＭＳＧ５０ＩＵ,，并于４８ｈ 后在模型組里面以隨機原則選３０只大鼠，同時在空白對照組里面選１０ 只大鼠,，將其處死之后摘取卵巢,，有效分離并且培養(yǎng) ＧＣ。對于模型組與對照組之中剩余大鼠,，分別為３０ 只與７ 只,，均以頸部皮下注射方式給予 ＨＣＧ２５ＩＵ，并在注射后第６天將其處死,，然后摘取卵巢有效分離并且培養(yǎng)卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞,。處于無菌條件下對所取卵巢進(jìn)行分離處理，去除附近脂肪組織，放于低倍顯微鏡下采?。玻?nbsp;號針頭將大鼠卵泡刺破,，并且輕拍擠壓，確保卵母細(xì)胞與其顆粒細(xì)胞同時順利逸出,。采用２００ 目鋼篩進(jìn)行過濾,，并在離心處理后收集顆粒細(xì)胞。選用０．４％ 臺盼藍(lán)進(jìn)行染色計數(shù),，如果鏡下沒有染為藍(lán)色,，說明是死細(xì)胞［４］?？刂?nbsp;ＧＣ 密度數(shù)值為１．０×１０５／ｍｌ,，并且接種于底面積２５ｃｍ２培養(yǎng)瓶里面，其中每培養(yǎng)瓶體積為 １ ｍｌ,，放 在 ３７℃ 且含 ５％ ＣＯ２ 相應(yīng)培養(yǎng)箱內(nèi)部恒溫培養(yǎng),。待大部分細(xì)胞基本貼壁之后需更換培養(yǎng)液，之后應(yīng)該每隔４８ｈ進(jìn)行１次更換,。待細(xì)胞培養(yǎng)４８ｈ,，需以０．１％ 胰酶消化，獲得單細(xì)胞懸液,，采取磷酸緩沖液沖洗２次,，并以４％ 多聚甲醛將其固定１０ ｍｉｎ。如果 ＨＥ染色顯示細(xì)胞形態(tài)完整,，外觀為多角形,，同時核呈深藍(lán)色，此外胞漿淡紅色伴隨許多顆粒,，且是 ＧＣ,，待其貼壁后備用［５］。
３．３ 調(diào)配含藥血清：將所選５０ 只６ 周實驗大鼠按照隨機原則分為補陽組,、滋陰組以及空白對照組,，采用中藥與 ０．９％ ＮａＣｌ溶液灌胃。對于灌胃給藥劑量,，必須是正常大鼠劑量十倍,，保證２ 次／ｄ，間隔時間為１２ｈ,，控制灌胃藥總體積≤３ ｍｌ,，且持續(xù)給藥３ｄ,，注意第３ｄ取血樣前嚴(yán)格禁食１２ｈ,，同時１ 次給予全天劑量，并于給藥１ｈ后進(jìn)行麻醉處理，再行心臟采血,。離心處理血樣之后,，同組血清混合，然后過濾,，置于５６ ℃ 溫度下滅活,，放在－２０ ℃條件存儲［６］。
３．４ 分組與藥物干預(yù)：對所培養(yǎng)獲得的顆粒細(xì)胞進(jìn)行分組,，共１０組,，且各組樣本包括５ 個復(fù)孔。具體干預(yù)措施為：空白對照組采用原代培養(yǎng)所獲得的正常大鼠 ＧＣ,；模型組１ 采用模型組大鼠 ＧＣ,；滋陰方組１采用含５％ 滋陰方藥相應(yīng)血清*培養(yǎng)液，其中包含 ＤＭＥＭ／Ｆ１２,、１％ 三抗以及１０％ＦＣＳ,；滋陰方組２采用含１０％ 滋陰方藥相應(yīng)血清*培養(yǎng)液進(jìn)行研究；滋陰方組３采用含２０％ 滋陰方藥相應(yīng)血清*培養(yǎng)液進(jìn)行研究,；補陽方組１采用含５％ 補陽方藥相應(yīng)血清*培養(yǎng)液進(jìn)行研究,； 補陽方組２采用含１０％ 補陽方藥相應(yīng)血清培養(yǎng)液進(jìn)行研究；補
ＰＣＲ 具體反應(yīng)程序完成后,，利用ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＳｏｆｔｗａｒｅ軟件自動獲取 ＱＲ 值,。以熒光定量 ＲＴ－ＰＣＲ 法［８］測定ＩＧＦ－１ 表達(dá)灰度值。
４ 觀察指標(biāo) 觀察各組細(xì)胞培養(yǎng)液里面 Ｅ２ ,、ＳＣＦ,、Ｔ 水平、ＩＧＦ－１表達(dá)灰度值及ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)情況,。
５ 統(tǒng)計學(xué)方法 選用ＳＰＳＳ１９．０ 統(tǒng)計學(xué)軟件分析觀察指
標(biāo)數(shù)據(jù),，其中計量資料以珚ｘ±ｓ 表示，計數(shù)資料以（％）表示,，分別用ｔ 值與 χ２ 值檢驗,。結(jié)果顯示 Ｐ ＜０．０５ 表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié) 果
１ 對照組,、模型組１與滋陰方組 ＧＣ 里面 Ｅ２ ,、ＳＣＦ 水平比
較 模型組１ＧＣ 里面 Ｅ２ 水平為（２４．５３±６．０２）ｐｍｏｌ／Ｌ，明顯低于對照組（３３．５４±６．０９）ｐｍｏｌ／Ｌ（Ｐ ＜０．０５）,，且 ＳＣＦ 水平（２７８６．
００±９４．００）ｐｇ／ｍｌ,，明顯高于對照組（２５４９．００±５８．００）ｐｇ／ｍＬ；
滋陰方組２ＳＣＦ（２４８９．００±１２７．００）ｐｇ／ｍｌ與滋陰方組 ３ＳＣＦ
（２４７３．００±１０９．００）ｐｇ／ｍＬ 均明顯低于模型組１（Ｐ ＜０．０５）,，而滋陰方組２Ｅ２（３３．２８±３．５７）ｐｍｏｌ／Ｌ 與滋陰方組３Ｅ２ （３３．８５±
２．３０）ｐｍｏｌ／Ｌ 均明顯高于模型組１（Ｐ＜０．０５）,。
２ 對照組,、模型組１ 與滋陰方組大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)情況、ＩＧＦ－１灰度值比較 模型組１ 大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表
達(dá)（１．０２±０．０３）明顯高于對照組（０．１３±０．１９）（Ｐ ＜０．０５）,，且
ＩＧＦ－１灰度值（１５４．９３±８．１７）明顯小于對照組（１６９．２０±２．６８）,；滋陰方組２ ＧＣ ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)（０．２３±０．０７）與滋陰方組 ３
ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表達(dá)（０．２０±０．１４）均顯著低于模型組１（Ｐ ＜０． ０５），滋陰方組３ＩＧＦ－１灰度值（１６７．０３±４．２６）明顯高于模型組
１（Ｐ＜０．０５）,。
３ 對照組,、模型組與補陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞里面Ｔ、ＳＣＦ 水平比較 模型組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞里面Ｔ 為（４．８９±０．４５）ｎｇ／ｍｌ,，明顯高于對照組（４．１１±０．
４７）ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）,；補陽方組２Ｔ（４．３５±０．２６）ｎｇ／ｍｌ與補陽方組３Ｔ（４．３２±０．２９）ｎｇ／ｍｌ明顯低于模型組（Ｐ ＜０．０５），而補陽方組１Ｔ 水平與模型組的比較無顯著差異（Ｐ ＞０．０５）,；５ 組 ＳＣＦ 水平比較無顯著差異（Ｐ＞０．０５）,，見表１。
表１ 對照組,、模型組與補陽方組大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞里面Ｔ,、ＳＣＦ 水平比較（珚ｘ±ｓ）
組 別 ｎ ＳＣＦ（ｐｇ／Ｌ） Ｔ（ｎｇ／ｍＬ）
陽方組
３采用含
２０％
補陽方藥相應(yīng)血清培養(yǎng)液進(jìn)行研究；空白
對照組采用原代培養(yǎng)所得正常大鼠卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行研究,；模型組采用模型組大鼠所得卵巢部位黃素化顆粒細(xì)胞進(jìn)行研究,。
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