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恒遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn),，一氧化氮合酶組織化學(xué)染色法的原理與過(guò)程
閱讀：627 發(fā)布時(shí)間：2014-3-26| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 67KB |
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一氧化氮合酶是一種連接酶,，能催化前體物質(zhì)L精氨酸L瓜氨酸和一氧化氮(NO)。NO是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的一種神經(jīng)遞質(zhì),，活細(xì)胞間信使和內(nèi)皮源性松弛血管的介質(zhì),，在神經(jīng),、心血管及免疫系統(tǒng)中有廣泛的作用。NO極不穩(wěn)定,。易于擴(kuò)散游離,，半衰期短，不易檢測(cè),。因NOS是合成NO的關(guān)鍵酶,，故通常通過(guò)檢測(cè)NOS的活性來(lái)評(píng)估NO的分布和功能。NOS有3種異構(gòu)型,，即神經(jīng)型NOS,、內(nèi)皮型NOS和細(xì)胞因子誘導(dǎo)型NOS,。由于還原型輔酶Ⅱ—黃遞酶與NOS在化學(xué)結(jié)構(gòu)和組織定位上有*的一致性,，且也與NO密切相關(guān)．故人們常采用NADPH-黃遞酶法來(lái)顯示NOS活性。
1,、原理：在βNADPH存在下,，NOS的C末端能將NADPH電子轉(zhuǎn)移到NBT，將NBT還原成不溶性藍(lán)紫色甲臘沉淀產(chǎn)物,。
2,、孵育液配制
β—NADPH 10mg
NBT 5mg
Triton X—100 0．03ml
0．05mol/L TB(pH 8．0) 9．97ml
臨用前配制。
3,、染色程序
① 固定：4％多聚甲醛(0．1mol/LPBS配制)灌流固定,，取材后入同樣固定液再固定1小時(shí)(4℃)，20％蔗糖中4℃放置一個(gè)晚上,；
② 冰凍切片：厚10—401．Lm,；
③ 孵育：切片人孵育液中37％孵育30分鐘～1小時(shí)；
④ 終止反應(yīng)：切片人0．05mol/LTB或蒸餾水中,；分鐘,；
⑤ 常規(guī)脫水、透明,、封片或直接用甘油明膠封片,。
4、結(jié)果與評(píng)價(jià)
反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色或藍(lán)紫色沉淀,。NADPH-黃遞酶法顯示NOS活性,，方法簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，應(yīng)用廣泛,，但不能區(qū)分NOS亞型,。
5、
在孵育液對(duì)照實(shí)驗(yàn)中除去β—NADPH或用0．1mol/L N—亞硝基精氨酸(NOS抑制劑)預(yù)孵育切片1小時(shí),，結(jié)果應(yīng)為陰性,。