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恒遠與您分享動物樣本前期處理
閱讀:1344 發(fā)布時間:2015-11-3一、勻漿介質的制備:
一般采用pH 7.4, 0.01mol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA-2Na, 0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化鈉溶液或直接用0.86%的生理鹽水作為勻漿介質,。
二,、組織勻漿的制備
1、取組織塊(0.1g~0.2g)zui少可到2~5mg在冰冷的生理鹽水中漂洗,,除去血液,濾紙拭干,,準確稱重,,放入5ml的勻漿管中。
2,、按重量(g):體積(ml)=1:9的比例加入9倍體積的勻漿介質(pH7.4,, 0.01mol/L Tris-HCl,,1mmol/L EDTA-2Na ,0.01mol/L蔗糖,0.8%的氯化鈉溶液)或者0.86%的生理鹽水于勻漿管中,冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊,。
3,、勻漿的方式有多種:手工勻漿,機器勻漿,,超聲粉碎。
① 手工勻漿:左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,,右手將搗桿垂直插入套管中,,上下轉動研磨數(shù)十次(6~8分鐘),,充分研碎,,制成10%的勻漿液。
② 機器勻漿:用組織搗碎機10000~15000 轉/分 上下研磨制成10%組織勻漿,,也可用內切式組織勻漿機制備(勻漿時間10秒/次,,間隙30秒,,連續(xù)3~5次,,在冰水中進行),皮膚,、肌肉組織等可延長勻漿時間。
③ 超聲粉碎:用超聲粉碎機進行粉碎,,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產超聲波發(fā)生儀,,用400安培,,5秒/次,,間隙10秒反復3~5次,。
鏡檢觀察:取少量組織勻漿作涂片(直接涂片,、染色均可以),顯微鏡下觀察細胞是否破碎,,若沒有則可延長勻漿時間,。
4、將制備好的10%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機2500轉/分左右,離心10~15分鐘,,取上清液進行測定.
三,、樣本保存:
動物組織樣本暫時不測定,可立即低溫凍存,,溫度越低越好,,中間如*凍融,,-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月。
制備好的勻漿液建議不要凍存,當天進行測定,如放置時間過長相關酶活會有所下降,部分指標4℃可存放3~5天(如SOD要存放2~3天,MDA可存放3~5,總蛋白測定可存5~7天等)
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