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恒遠(yuǎn)生物|酶的提取、分離,、活力檢測與純化
閱讀：567 發(fā)布時間：2024-6-19一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br/>
酶是植物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì),，植物體內(nèi)的生化反應(yīng)一般都在酶的作用下進(jìn)行,，沒有酶的催化反應(yīng)，植物生命也就停止了,，因此對酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分,。研究酶先要將酶從組織中提取出來，加以分離,、純化,，不同的研究目的對酶制劑的純度要求也不同，有些工作只需粗的酶制劑即可,，而有些工作則要求較純的酶制劑,，根據(jù)不同情況區(qū)別對待。在酶的提取和純化過程中,，自始至終都需要測定酶的活性,，通過酶活性的測定以監(jiān)測酶的去向。
二,、實(shí)驗(yàn)原理
（1）酶的提取
1.酶存在于動植物以及微生物的細(xì)胞的各個部位,。
2.酶如何從細(xì)胞中分離
??從高等植物中提取酶常遇到一些實(shí)際問題，先是細(xì)胞中含有許多種酶,，每種酶的濃度又很低,，只占細(xì)胞總蛋白質(zhì)中的小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質(zhì)的含量又很低,。此外,，各種酶的存在狀態(tài)不同，有外酶,、內(nèi)酶,，內(nèi)酶中有與細(xì)胞器一定結(jié)構(gòu)相結(jié)合的結(jié)合酶，也有的存在于細(xì)胞質(zhì)中,，提取時都應(yīng)區(qū)別對待,，作不同處理。如果酶僅存在于細(xì)胞質(zhì)中,，只要將細(xì)胞破碎,，酶就會轉(zhuǎn)移到提取液中；但如果是與細(xì)胞器（如細(xì)胞壁,、細(xì)胞核,、線粒體,、原生質(zhì)膜、微粒體等）緊密結(jié)合的酶,，這時僅破碎細(xì)胞還不夠,，還需用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚笍倪@些結(jié)構(gòu)上溶解下來。其次,，細(xì)胞中存在抑制物質(zhì),，如酚，酸,，離子等,，它們通常在液泡中，當(dāng)細(xì)胞破碎時,，這些物質(zhì)象蛋白質(zhì)一樣從細(xì)胞中釋放出來,，進(jìn)入提取液中，特別是酚類物質(zhì),，具有游離的酚羥基,，能與蛋白質(zhì)肽鍵的氧原子形成強(qiáng)的氫鍵，不能為一般的實(shí)驗(yàn)方法,，如透析和凝膠過濾所解離,。如果沒有特殊需要，一般選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗,，在這些組織中一般酚類化合物含量較低,。在提取過程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH值的緩沖溶液,，在高pH值時,，酚類大部游離而不與蛋白質(zhì)形成強(qiáng)的氫鍵，但高pH值促進(jìn)酚類氧化,，同時降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性,，通常采用pH6.7梍7.2。PVP能與游離酚羥基形成強(qiáng)的氫鍵復(fù)合物,，是酚類化合物的有效結(jié)合劑。在提取線粒體時加入可溶性PVP,，提取可溶性酶時加入不溶性交聯(lián)PVP,，能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及PVP單體,，可加10% HCl煮沸10分鐘,，用NaOH中和，再用水洗幾次,，直至中性,，純化后的PVPP可直接應(yīng)用,。
植物細(xì)胞有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，需要強(qiáng)烈的方法去破碎,，少量樣品可用研缽加石英砂研磨,，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動勻漿器,。為減低研磨或勻漿過程中發(fā)熱,，所用器皿和溶液需要預(yù)冷，提取液的用量一般為組織的1梍5倍,，用量大些有利于提高得率,，但工作量大。提取勻漿時加入酚類結(jié)合劑PVPP,，金屬螯合劑Na2─EDTA,，以及─SH化合物以保護(hù)蛋白質(zhì)，或加入非離子型去垢劑如Triton X─100,，以增加蛋白質(zhì)的可溶度,，常用于與膜脂結(jié)合的酶。（可以通過試驗(yàn)以確定提取蛋白質(zhì)的最佳條件,。）
（2）離和純化
1.上面制備得到的提取液中,，除含有所需要的酶外，還含有其他蛋白質(zhì),，以及其他大分子和小分子化合物雜質(zhì),。
2.如何將酶從粗提液中分離純化
要在許多蛋白質(zhì)的混合物中分離出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有鹽析法,，往層析法,，薄膜超濾法，親和層析法,，電泳法等,。在大體積的提取液中一般先采用硫酸銨分級鹽析沉淀。鹽析法是提純酶使用最早的方法之一,，在高濃度的鹽溶液中酶蛋白不易變性而失去活性,，利于工作在室溫中進(jìn)行。不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低,，鹽析法就是利用這一性質(zhì),，將不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離，選擇合適飽和度的硫酸銨,，使沉淀的蛋白質(zhì)酶活性最大,。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心后收集，再溶于少量緩沖溶液中，經(jīng)透析或凝膠柱過濾,，以除去硫酸銨及其他小分子雜質(zhì),，再經(jīng)過柱層析分離。由于吸附劑的不同,，又有吸附柱層析,、離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析等。對于不同的支持物采用的洗脫方法也不同,，分子篩類型凝膠過濾柱層析,，洗脫液只要用一定濃度的緩沖液就可以了。對于吸附柱和離子交換柱層析,，往往要采用濃度梯度溶液進(jìn)行洗脫,，最-方便的是線性梯度濃度，當(dāng)然用非線性梯度會得到更好的分離效果,。目前柱層析和硫酸銨分級沉淀一樣,，已成為常規(guī)酶的分離提純步驟之一。
??近年來純化酶常用的一種有效方法為親和層析,。主要利用酶和底物,、抑制劑或輔酶具有一定的結(jié)合能力，這一性質(zhì)即可用來分離,、提純酶,。先選擇支持物，如瓊脂糖將底物,、競爭性抑制劑或輔酶,，以共價(jià)鍵的形式連接到支持物上，然后把含有酶的溶液,，流過裝有專一性底物,、競爭抑制劑或輔酶的層析柱，酶即被保留在支持物上,，再充分洗滌除去未被吸附的雜質(zhì),，然后用含有一定濃度的底物或競爭性抑制劑或輔酶的緩沖液，進(jìn)行競爭性洗脫,。（親和劑選擇合適,，能得到較高純度的酶，是酶分離,、純化中既方便又有效的一種方法,。）
（3）酶活力的測定
酶的活力表現(xiàn)為催化某一反應(yīng)的速度，反應(yīng)速度越大,，酶的活力也越大，酶催化的反應(yīng)速度可以用單位時間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的積累量來表示,。由于酶的催化作用和周圍環(huán)境的關(guān)系十分密切,，環(huán)境的溫度,、pH、離子強(qiáng)度等都對酶的活力有很大的影響,，因此測定酶活力時應(yīng)該使這些條件保持恒定,。
酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分鐘所分解的底物量（或生成的產(chǎn)物量）μmol數(shù)表示。測定酶活性的方法很多,，常因反應(yīng)的底物和產(chǎn)物的性質(zhì)不同選用不同的方法,，應(yīng)用最-廣泛的是比色法或分光光度法。凡反應(yīng)系統(tǒng)中的化合物在紫外區(qū)或可見光區(qū)有吸收峰的都可以用這種方法進(jìn)行測定,。如果催化的反應(yīng)系統(tǒng)中需要ATP或產(chǎn)生ATP,，如一些激酶；或是有NAD存在,，如一些脫氫酶和氧化還原酶,；或反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，如一些氧化酶,，這些酶的活性可以用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行測定,。測定酶活性的方法很多，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇合適的方法,。